DNA järjestamine: määratlus, meetodid, näited

Nukleotiidid on elu keemilised ehituskivid ja neid leidub elusorganismide DNA-s. Iga nukleotiid koosneb suhkur, fosfaat ja a lämmastikku sisaldav alus: adeniin (A), tümiin (T), tsütosiin (C) ja guaniin (G). Nende nukleotiidaluste konkreetne järjestus määrab, milliseid valke, ensüüme ja molekule rakk sünteesib.

Nukleotiidide järjestuse või järjestuse määramine on oluline mutatsioonid, evolutsioon, haiguse progresseerumine, geneetiline testimine, kohtuekspertiis ja meditsiin.

Genoomika on DNA, geenide, geenide vastasmõju ja keskkonnamõjude uurimine geenidele. Geenide keeruka sisemise töö lahti harutamise saladus on võime tuvastada nende struktuur ja asukoht kromosoomides.

Elusorganismide plaan määratakse DNA nukleiinhappe aluspaaride järjestuse (või järjestuse) järgi. Kui DNA kordub, paaristub adeniin tümiiniga ja tsütosiin guaniiniga; arvestatakse mittevastavaid paare mutatsioonid.

Kuna topeltheeliks desoksüribonukleiinhape (DNA) molekul kontseptualiseeriti 1953. aastal, dramaatilisi edusamme on tehtud genoomika ja suuremahulise DNA järjestamise valdkonnas. Teadlased töötavad usinalt selle uue teadmise rakendamisel haiguste individualiseeritud ravimisel.

Samal ajal võimaldavad käimasolevad arutelud teadlastel hoida ette sellise kiiresti plahvatava tehnoloogia eetilistest tagajärgedest.

DNA järjestamine on protsess, mille käigus avastatakse DNA juppidest erinevate nukleotiidaluste järjestus. Tervete geenide järjestamine võimaldab võrrelda kromosoome ja genoome, mis esinevad ühel ja samal liigil.

Kromosoomide kaardistamine on teadusuuringute jaoks kasulik. Analüüsides mehhanisme ja struktuuri geenid, alleelid ja DNA molekulide kromosomaalsed mutatsioonid pakuvad uusi viise geneetiliste häirete raviks ja näiteks vähkkasvaja kasvu peatamiseks.

Frederick Sangeri DNA järjestamise meetodid alates 1970. aastatest edendas genoomika valdkonda oluliselt. Pärast insuliini uurimisel oli Ranger edukalt sekveneerinud RNA DNA sekveneerimisega valmis. Sanger polnud esimene teadlane, kes DNA sekveneerimise kallale asus. Kuid tema nutikad DNA sekveneerimismeetodid, mis töötati välja koos kolleegide Bergi ja Gilbertiga, pälvisid 1980. aastal Nobeli preemia.

Sanger teadis oma töö potentsiaalset väärtust ja tegi sageli koostööd teiste teadlastega, kes jagasid tema huve DNA vastu, molekulaarbioloogia ja eluteadus.

Ehkki praeguste sekveneerimistehnoloogiatega võrreldes on see aeglane ja kallis, kiideti toona Sangeri DNA järjestamismeetodeid. Pärast katseid ja vigu leidis Sanger salajase biokeemilise „retsepti“ DNA-ahelate eraldamiseks, DNA loomiseks ja nukleotiidide järjestuse tuvastamiseks genoomis.

Laboratoorsetes uuringutes kasutamiseks saab hõlpsasti osta kvaliteetseid materjale:

• DNA polümeraas on DNA tootmiseks vajalik ensüüm.
• DNA praimer ütleb ensüümile, kust alustada DNA ahelaga töötamist.
• dNTP-d on orgaanilised molekulid, mis koosnevad desoksüriboossuhkrust ja nukleosiidtrifosfaatidest - dATP, dGTP, dCTP ja dTTP - mis ühendavad valke
• Keti-terminaatorid on värvivärvi nukleotiidid, mida nimetatakse ka iga aluse - A, T, C ja G - terminaatornukleotiidideks.

Sanger mõtles välja, kuidas DNA ensüümi DNA polümeraasi abil väikesteks segmentideks lõigata.

Seejärel tegi ta matriitsist rohkem DNA-d ja sisestas eraldatud ahelate sektsioonide piiritlemiseks uude DNA-sse radioaktiivsed märgistusained. Ta tunnistas ka seda, et ensüüm vajab praimerit, mis suudaks kinnituda matriitsil oleva kindla kohaga. 1981. aastal tegi Sanger taas ajalugu, selgitades välja mitokondriaalse DNA 16 000 aluspaari genoomi.

Temperatuuri tuleb kogu sekveneerimisprotsessi jooksul hoolikalt reguleerida. Kõigepealt lisatakse torusse kemikaale ja kuumutatakse kaheahelalise lahti harutamiseks (denatureerimiseks) DNA molekul. Seejärel jahutatakse temperatuur, lastes praimeril siduda.

Järgmisena tõstetakse temperatuuri, et soodustada DNA polümeraasi (ensüümi) optimaalset aktiivsust.

Polümeraas kasutab tavaliselt olemasolevaid normaalseid nukleotiide, mis lisatakse suurema kontsentratsiooniga. Kui polümeraas jõuab "ahelaga lõppeva" värviga seotud nukleotiidini, siis polümeraas peatub ja ahela otsad seal, mis seletab, miks värvitud nukleotiide nimetatakse “ahelaga lõppevateks” või "Terminaatorid".

Protsess jätkub mitu-mitu korda. Lõpuks on värviga seotud nukleotiid paigutatud DNA järjestuse igasse üksikusse. Geelelektroforees ja arvutiprogrammid võimaldavad seejärel tuvastada värvaineid igas DNA ahelas ja välja arvutada kogu DNA järjestus, mis põhineb värvil, värvipositsioonil ja värvipikkusel kiud.

Suure läbilaskevõimega järjestamine - üldiselt nimetatakse seda järgmise põlvkonna järjestamine - kasutab uusi edusamme ja tehnoloogiaid nukleotiidide aluste järjestamiseks kiiremini ja odavamalt kui kunagi varem. DNA järjestamise masin saab hõlpsasti hakkama suuremahuliste DNA osadega. Tegelikult saab Sangeri sekveneerimistehnikate abil kogu genoomi teha mõne tunni, mitte aastate jooksul.

Järgmise põlvkonna sekveneerimismeetodid saavad hakkama suure mahuga DNA analüüsiga ilma lisatud amplifikatsiooni või kloonimise etapita, et saada sekveneerimiseks piisavalt DNA-d. DNA-järjestusmasinad viivad korraga läbi mitu sekveneerimisreaktsiooni, mis on odavam ja kiirem.

Põhimõtteliselt käivitab uus DNA järjestamise tehnoloogia sadu Sangeri reaktsioone väikesel hõlpsasti loetaval mikrokiibil, mis seejärel juhitakse läbi järjestuse kokku paneva arvutiprogrammi.

Tehnikaga loetakse lühemaid DNA fragmente, kuid see on siiski kiirem ja tõhusam kui Sangeri sekveneerimismeetodid, nii et isegi suuremahulised projektid saab kiiresti lõpule viia.

The Inimgenoomi projekt, mis valmis 2003. aastal, on üks kuulsamaid sekveneerimisuuringuid, mida on siiani tehtud. Vastavalt 2018. aasta artiklile Teadusuudised, koosneb inimese genoom ligikaudu 46,831 geeni, mis oli järjestuse jaoks suur väljakutse. Üle maailma tippteadlased veetsid koostööd ja nõu pidades peaaegu 10 aastat. Riikliku inimgenoomiuuringute eestvedamisel

Instituut kaardistas projekt anonüümsetelt veredoonoritelt võetud liitproovi abil edukalt inimese genoomi.

Inimgenoomi projekt tugines aluspaaride kaardistamiseks bakterite kunstliku kromosoomi (BAC-põhised) sekveneerimismeetoditele. Tehnika abil kasutati DNA fragmentide kloonimiseks baktereid, mille tulemuseks oli sekveneerimiseks suur DNA kogus. Seejärel vähendati kloonide suurust, pandi järjestamismasinasse ja pandi kokku inimese DNA-d tähistavateks osadeks.

Uued avastused genoomikas muudavad põhjalikult lähenemisviise haiguste ennetamisele, avastamisele ja ravile. Valitsus on DNA-uuringutele eraldanud miljardeid dollareid. Korrakaitse tugineb juhtumite lahendamisel DNA analüüsile. DNA testimise komplekte saab osta koduseks kasutamiseks, et uurida esivanemaid ja tuvastada geenivariante, mis võivad põhjustada terviseriske:

• Genoomanalüüs tähendab paljude eri liikide genoomijärjestuste võrdlemist ja vastandamist elu valdkondades ja kuningriikides. DNA järjestamine võib paljastada geneetilisi mustreid, mis heidavad uut valgust, kui teatud järjestused on evolutsiooniliselt sisse viidud. Esivanemat ja rännet saab jälgida DNA analüüsi abil ja võrrelda ajalooliste andmetega.

• Meditsiini edusammud toimuvad eksponentsiaalse kiirusega, sest praktiliselt igal inimese haigusel on geneetiline komponent. DNA järjestamine aitab teadlastel ja arstidel mõista, kuidas mitmed geenid omavahel ja keskkonnaga suhtlevad. Haiguse puhangut põhjustava uue mikroobi DNA kiire järjestamine võib aidata leida tõhusaid ravimeid ja vaktsiine, enne kui probleemist saab tõsine rahvatervise probleem. Vähirakkude ja kasvajate geenivariante võiks järjestada ja kasutada individuaalsete geeniteraapiate väljatöötamiseks.

• Kohtuekspertiis rakenduse abil on õiguskaitseorganid aidanud 1980ndate lõpust alates tuhandeid keerulisi juhtumeid murda Riiklik justiitsinstituut. Kuriteopaiga tõendid võivad sisaldada luust, juustest või kehakudest pärinevaid DNA proove, mida saab süü või süütuse tuvastamiseks võrrelda kahtlusaluse DNA profiiliga. Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) on tavaliselt kasutatud meetod DNA-st koopiate tegemiseks jäljenditest enne sekveneerimist.

• Äsja avastatud liikide järjestamine aitab tuvastada, millised teised liigid on kõige tihedamalt seotud, ja paljastada teavet evolutsiooni kohta. Taksonoomid kasutavad organismide klassifitseerimiseks DNA „vöötkoode”. Vastavalt Georgia ülikool 2018. aasta mais on hinnanguliselt veel 303 imetajaliiki.

• Haiguste geneetiline testimine otsige muteerunud geenivariante. Enamik neist on ühe nukleotiidi polümorfismid (SNP-d), mis tähendab, et järjestuses on muudetud ainult ühte nukleotiidi tavalisest versioonist. Keskkonnategurid ja elustiil mõjutavad seda, kuidas ja kas teatud geenid avalduvad. Ülemaailmsed ettevõtted teevad tipptasemel uue põlvkonna sekveneerimistehnoloogiad kättesaadavaks kogu maailma teadlastele, kes on huvitatud multigeenide interaktsioonidest ja kogu genoomi järjestustest.

• Genealoogia DNA komplektid kasutage oma andmebaasis DNA järjestusi, et kontrollida üksikute geenide variante. Komplekti jaoks on vaja süljeproovi või põsepulka, mis saadetakse analüüsimiseks kaubanduslaborisse. Lisaks esivanematega seotud teabele võivad mõned komplektid tuvastada ühe nukleotiidi polümorfismi (SNP) või muud tuntud geneetilised variandid nagu BRCA1 ja BRCA2 geenid, mis on seotud kõrgendatud riskiga emasrindadele ja munasarjavähk.

Uute tehnoloogiatega kaasnevad sageli nii sotsiaalse kasu kui ka kahju võimalused; näited hõlmavad rikkis tuumajaamu ja massihävitusrelvi. Ka DNA tehnoloogiatega kaasnevad riskid.

Emotsionaalsed mured DNA järjestamise ja geenide redigeerimise vahendite, nagu CRISPR, pärast hõlmavad hirme, et tehnoloogia võib hõlbustada inimese kloonimist või viia petturitest loodud mutantsete transgeensete loomadeni teadlane.

DNA sekveneerimisega seotud eetikaküsimused on sagedamini seotud teadliku nõusolekuga. Lihtne juurdepääs otse tarbijale tehtavatele DNA testidele tähendab, et tarbijad ei pruugi täielikult aru saada, kuidas nende geneetilist teavet kasutatakse, salvestatakse ja jagatakse. Tavainimesed ei pruugi olla emotsionaalselt valmis oma defektsete geenivariantide ja terviseriskide tundmaõppimiseks.

Kolmandad isikud, näiteks tööandjad ja kindlustusseltsid, võivad potentsiaalselt diskrimineerida inimesi, kellel on defektsed geenid, mis võivad põhjustada tõsiseid meditsiinilisi probleeme.