La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, es una técnica que fotocopia un fragmento de ADN en muchos fragmentos, exponencialmente muchos. El primer paso en la PCR es calentar el ADN para que se desnaturalice o se derrita en hebras simples. La estructura del ADN es como una escalera de cuerda en la que los peldaños son cuerdas con extremos magnéticos. Los imanes se conectan para formar los peldaños, llamados pares de bases, y así resisten ser separados. Cada fragmento de ADN se funde en hebras individuales a diferentes temperaturas. Comprender cómo la estructura del ADN se mantiene unida por las partes individuales del ADN dará una idea de por qué diferentes fragmentos de ADN se funden a diferentes temperaturas y por qué se necesitan temperaturas tan altas en la primera lugar.
¡Derritiendo! ¡Derritiendo!
El primer paso de la PCR es fundir el ADN para que el ADN bicatenario se separe en ADN monocatenario. Para el ADN de mamíferos, este primer paso generalmente implica un calor de aproximadamente 95 grados centígrados (aproximadamente 200 Fahrenheit). A esta temperatura, los enlaces de hidrógeno entre los pares de bases A-T y G-C, o peldaños en la escalera del ADN, se rompen y abren la cremallera del ADN de doble hebra. Sin embargo, la temperatura no es lo suficientemente alta como para romper la columna vertebral de fosfato-azúcar que forma las hebras simples o los polos de la escalera. La separación completa de las hebras simples las prepara para el segundo paso de la PCR, que es el enfriamiento para permitir que fragmentos cortos de ADN, llamados cebadores, se unan a las hebras simples.
Cremalleras magnéticas
Una de las razones por las que el ADN se calienta a una temperatura alta de 95 grados centígrados es que cuanto más larga es la doble hebra de ADN, más desea permanecer unida. La longitud del ADN es un factor que afecta el punto de fusión elegido para la PCR en ese fragmento de ADN. Los pares de bases A-T y G-C en el ADN de doble hebra se unen entre sí para mantener unida la estructura de doble hebra. Cuantos más pares de bases consecutivos se hayan unido entre dos hebras simples, más querrán unirse sus vecinos y más fuerte será la atracción entre las dos hebras. Es como una cremallera hecha de pequeños imanes. Al cerrar la cremallera, los imanes naturalmente querrán cerrarse y permanecer cerrados.
Los imanes más fuertes se adhieren más firmemente
Otro factor que afecta qué temperatura de fusión elegir para su fragmento de ADN de interés es la cantidad de pares de bases G-C presentes en ese fragmento. Cada par de bases es como dos mini imanes que se atraen. Un par hecho de G y C se atrae mucho más fuertemente que un par A y T. Por lo tanto, un fragmento de ADN que tiene más pares G-C que otro fragmento requerirá una temperatura más alta antes de fundirse en hebras simples. El ADN absorbe de forma natural la luz ultravioleta, en la longitud de onda de 260 nanómetros, para ser exactos, y el ADN monocatenario absorbe más luz que el ADN bicatenario. Por lo tanto, medir la cantidad de luz absorbida es una forma de medir cuánto su ADN de doble hebra se ha derretido en hebras simples. El efecto de "cremallera magnética" de los pares de bases G-C y A-T es lo que provoca un gráfico de la absorbancia de luz de El ADN de doble hebra representado frente a un aumento de temperatura es sigmoidal, con forma de S y no de línea recta. La curva de la S representa la resistencia del trabajo en equipo que los pares de bases ejercen contra el calor porque no quieren separarse.
El punto medio
La temperatura a la que una longitud de ADN se funde en hebras simples se denomina temperatura de fusión, que se indica con la abreviatura "Tm". Esto indica la temperatura a la que la mitad del ADN en una solución se ha derretido en hebras simples y la otra mitad todavía está en hebras dobles. formulario. La temperatura de fusión es diferente para cada fragmento de ADN. El ADN de los mamíferos tiene un contenido de G-C del 40%, lo que significa que el 60% restante de los pares de bases son As y Ts. Su contenido del 40% de G-C hace que el ADN de los mamíferos se derrita a 87 grados centígrados (aproximadamente 189 Fahrenheit). Es por eso que el primer paso de la PCR en el ADN de los mamíferos es calentarlo a 94 grados centígrados (201 Fahrenheit). Solo siete grados más caliente que la temperatura de fusión y todas las hebras dobles se derretirán por completo en hebras simples.