Las membranas celulares constan de fosfolípidos y proteínas adheridas o incrustadas. Las proteínas de membrana juegan un papel vital en el metabolismo y la vida de la célula. No se puede utilizar la microscopía ordinaria para visualizar o caracterizar proteínas de adhesión, proteínas de transporte y canales de proteínas en la membrana celular. Mediante microscopía electrónica y una técnica llamada "fractura por congelación", que divide las membranas celulares congeladas, permite la visualización de la estructura de la membrana y la organización de las proteínas dentro del mar de fosfolípidos. La combinación de otros métodos con la fracturación por congelación no solo nos ayuda a comprender la estructura de diferentes membranas celulares y proteínas de membrana, pero permite la visualización y análisis detallado de la función de proteínas específicas, bacterias y virus.
Pasos básicos en la fractura por congelación
Usando nitrógeno líquido, las muestras de tejido biológico o las células se congelan rápidamente para inmovilizar los constituyentes celulares. Las membranas celulares están compuestas por dos capas de fosfolípidos, llamadas bicapa, donde las colas de lípidos hidrófobas o que odian el agua apuntan a el interior de la membrana y los extremos hidrófilos, o amantes del agua, de la molécula de lípidos apuntan hacia afuera y hacia el interior de la célula. La muestra congelada se agrieta o fractura con un micrótomo, que es un instrumento similar a un cuchillo para cortar láminas delgadas de tejido. Esto hace que la membrana celular se separe con precisión entre las dos capas porque la atracción entre las colas de lípidos hidrófobos representa el punto más débil. Después de la fractura, la muestra se somete a un procedimiento de vacío, llamado "grabado por congelación". La superficie del fracturado La muestra se sombrea con vapor de carbono y platino para hacer una réplica estable, que sigue los contornos de la fractura. avión. El ácido se usa para digerir el material orgánico que se adhiere a la réplica, dejando una capa delgada de platino en la superficie de la membrana fracturada. Luego, esta capa se analiza mediante microscopía electrónica.
Congelar aguafuerte
El grabado por congelación es el secado al vacío de una muestra biológica sin fijar, congelada y fracturada por congelación. El procedimiento de secado al vacío es similar al secado por congelación de frutas y verduras que se empaquetan y venden en las tiendas de comestibles. Sin el grabado por congelación, los cristales de hielo oscurecen muchos detalles de la estructura celular. El paso de grabado profundo o congelado mejora y amplía el método de congelación-fractura original, lo que permite la observación de las membranas celulares durante diversas actividades. Permite el análisis no solo de la estructura de la membrana, sino también de los componentes intracelulares. y proporciona información estructural detallada sobre bacterias, virus y proteínas celulares grandes complejos.
Microscopio de electrones
La microscopía electrónica puede revelar y ampliar más de un millón de veces los organismos o estructuras más diminutos, como bacterias, virus, componentes intracelulares e incluso proteínas. La visualización se crea bombardeando una muestra ultrafina con un haz de electrones. Los dos métodos de microscopía electrónica son la microscopía electrónica de barrido, o SEM, y la microscopía electrónica de transmisión, o TEM. Las muestras de fracturas por congelación se analizan de forma rutinaria con TEM. TEM tiene mejor resolución que SEM y ofrece información estructural de hasta 3 nanómetros de réplicas.
Revelando la estructura de la membrana celular
El desarrollo y uso de la microscopía electrónica de congelación y fractura mostró que las membranas plasmáticas celulares están formadas por bicapas lipídicas y aclararon cómo se organizan las proteínas dentro de las membranas celulares. La fractura por congelación da una apariencia única al interior de las membranas celulares, porque divide y separa los fosfolípidos de la membrana en dos láminas o caras opuestas y complementarias. En los más de 50 años transcurridos desde la introducción de la primera máquina de fractura por congelación, hacer una réplica de platino sigue siendo la única forma de obtener información estructural sobre la membrana celular. La técnica muestra si las proteínas específicas flotan o están ancladas en la membrana celular, y si algunas proteínas se agregan y cómo. Un método más nuevo, que utiliza anticuerpos que se dirigen a proteínas específicas, se combina con la fractura por congelación para identificar las proteínas y su función en la membrana celular.
