En biología molecular, se puede elegir una buena solución tampón y una buena preparación para diferentes pasos de aislamiento de ADN la diferencia entre pasar a la expresión de proteínas o abrir otro kit de preparación máxima para comenzar encima. A pesar de su importancia crucial, las recetas tampón a menudo son solo eso: recetas escritas sin explicación o justificación para los diferentes componentes. Uno de estos tampones es el tampón glucosa-tris-EDTA o GTE.
¿Para qué se utiliza GTE?
GTE se utiliza para resuspender los sedimentos de células bacterianas antes de lisar (romper) las células y recolectar el ADN plasmídico del interior. La lisozima, que suaviza las membranas celulares, a menudo se agrega junto con el tampón GTE. Lograr una suspensión homogénea de células completas durante este paso para que la solución de lisis añadida posteriormente pueda llegar a todas las células es clave para obtener buenos rendimientos de ADN. GTE está diseñado para hacer esto al mismo tiempo que proporciona un entorno estable para el ADN.
Glucosa para la osmolaridad
Se agrega azúcar de glucosa 50 mM (milimolar) al tampón GTE para mantener la osmolaridad donde la concentración de soluto fuera de las células es cercana a la del interior de las células. Esto previene la lisis celular prematura, que puede causar menores rendimientos de ADN debido a la agregación y degradación. Los otros componentes del tampón también contribuyen a la osmolaridad de la solución, pero la glucosa, al ser un electrolito, es una buena opción porque no interfiere con el tampón de la solución propiedades.
Tris para la estabilidad del pH
Tris es el nombre corto de tris (hidroximetil) aminometano, que es un tampón de pH muy común. En el caso del tampón GTE, la sal ácida (Tris-HCl) se añade al tampón a una concentración de 25 mM. Esto mantiene el pH de la solución en un 8,0 casi fisiológico, un pH ideal para prevenir la hidrólisis ácida (degradación) del ADN del plásmido y reacciones secundarias no deseadas de los otros componentes celulares.
EDTA previene la degradación del ADN
El EDTA, o ácido etilendiaminotetraacético, captura o "quela" los iones metálicos de la solución, evitando que participen en reacciones secundarias no deseadas. En el tampón GTE, se agrega EDTA a 10 mM. Su propósito principal es en el búfer para redondear el zinc, el magnesio y el calcio libres, evitando así la degradación del ADN por ciertas vías que requieren esos metales.
Algunos consejos importantes
Mantenga su tampón GTE frío y hágalo en pequeñas cantidades para evitar el crecimiento de bacterias no deseadas en él. El azúcar y el pH controlado lo convierten en un excelente medio de crecimiento. Utilice siempre agua purificada. El agua del grifo puede tener un exceso de iones metálicos de las tuberías, lo que puede abrumar la capacidad de captura del EDTA. Si sospecha la presencia de ARN interferente en su muestra, agregue ARNasa A a 100 microgramos por mililitro a su tampón GTE para eliminar el problema.