La clonación molecular es un método biotecnológico común con el que todo estudiante e investigador debería estar familiarizado. Clonación molecular que utiliza un tipo de enzima llamada enzima de restricción para cortar el ADN humano en fragmentos que luego se pueden insertar en el ADN plasmídico de una célula bacteriana. Las enzimas de restricción cortan el ADN de doble hebra por la mitad. Dependiendo de la enzima de restricción, el corte puede resultar en un extremo pegajoso o romo. Los extremos pegajosos son más útiles en la clonación molecular porque aseguran que el fragmento de ADN humano se inserte en el plásmido en la dirección correcta. El proceso de ligación, o fusión de fragmentos de ADN, requiere menos ADN cuando el ADN tiene extremos pegajosos. Por último, múltiples enzimas de restricción de extremos pegajosos pueden producir el mismo extremo pegajoso, aunque cada enzima reconozca una secuencia de restricción diferente. Esto aumenta la probabilidad de que la región de interés de su ADN pueda ser eliminada por enzimas adhesivas.
Enzimas de restricción y sitios de restricción
Las enzimas de restricción son enzimas que cortan, reconocen secuencias específicas en el ADN de doble hebra y cortan el ADN por la mitad en esa secuencia. La secuencia reconocida se llama sitio de restricción. Las enzimas de restricción se denominan endonucleasas porque cortan el ADN de doble hebra, que es como existe normalmente el ADN, en ubicaciones que se encuentran entre los extremos del ADN. Hay más de 90 enzimas de restricción diferentes. Cada uno reconoce un sitio de restricción distinto. Las enzimas de restricción escinden sus respectivos sitios de restricción 5.000 veces más eficientemente que otros sitios que no reconocen.
La orientación correcta
Las enzimas de restricción vienen en dos clases generales. Cortan el ADN en extremos pegajosos o romos. Un extremo pegajoso tiene una región corta de nucleótidos, los componentes básicos del ADN, que no está emparejada. Esta región no apareada se llama voladizo. Se dice que el voladizo es pegajoso porque quiere y se emparejará con otro extremo adhesivo que tiene una secuencia de voladizo complementaria. Los extremos pegajosos son como gemelos perdidos hace mucho tiempo que buscan abrazarse con fuerza una vez que se encuentran. Por otro lado, los extremos romos no son pegajosos porque todos los nucleótidos ya están emparejados entre las dos hebras de ADN. La ventaja de los extremos pegajosos es que un fragmento de ADN humano solo puede caber en un plásmido bacteriano en una dirección. Por el contrario, si tanto el ADN humano como el plásmido bacteriano tienen extremos romos, el ADN humano puede insertarse de cabeza a cola o de cola a cabeza en el plásmido.
Ligar los extremos pegajosos requiere menos ADN
Aunque el ADN con extremos en forma de varilla tiene más facilidad para encontrarse entre sí debido a su "adherencia", ni los extremos pegajosos ni los extremos romos pueden fusionarse en una pieza continua de ADN. La formación de una pieza continua de ADN que está completamente ligada requiere una enzima llamada ligasa. Las ligasas conectan la columna vertebral de los nucleótidos en los extremos pegajosos o romos, lo que da como resultado una cadena continua de nucleótidos. Debido a que los extremos pegajosos se encuentran más rápido debido a su atracción entre sí, el proceso de ligadura requiere menos ADN humano y menos ADN plasmídico. Es menos probable que los extremos romos del ADN y los plásmidos se encuentren entre sí y, por lo tanto, la ligadura de los extremos romos requiere que se coloque más ADN en el tubo de ensayo.
Diferentes enzimas pueden dar el mismo final pegajoso
Los sitios de restricción se encuentran en todo el genoma de los organismos, pero no están espaciados uniformemente. En los plásmidos, pueden diseñarse para ubicarse uno al lado del otro. Los científicos que quieran cortar un fragmento de ADN humano del genoma humano deben encontrar sitios de restricción que estén delante y detrás de la región del fragmento. Además de garantizar que un fragmento de ADN se inserte en la dirección correcta, diferentes enzimas de extremo pegajoso pueden crear el mismo extremo pegajoso aunque reconozcan diferentes secuencias de restricción. Por ejemplo, BamHI, BglII y Sau3A tienen diferentes secuencias de reconocimiento pero producen el mismo extremo adhesivo GATC. Esto aumenta la probabilidad de que haya sitios de restricción de extremos pegajosos que flanqueen su gen humano de interés.