La electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) es un método bioquímico para identificar proteínas en solución. Como ilustran Mathews et al en "Biochemistry", las muestras de proteína se cargan primero en "pozos" o agujeros en un extremo del bloque de gel de poliacrilamida. Luego se aplica un campo eléctrico al gel. El SDS, agregado a las muestras cargadas, niega la carga natural de las proteínas. Por esta razón, el peso molecular de la proteína por sí solo determina la velocidad de migración de las proteínas a medida que se mueven a través del gel hacia el polo cargado positivamente, señala Bitesize Bio. Por lo tanto, múltiples proteínas en la misma muestra se separarán entre sí y migrarán a diferentes posiciones.
Oriente la fotografía en gel. "Arriba" es la ubicación de los pozos donde se agregaron originalmente las muestras. "Abajo" es donde las muestras migraron hacia y más a menudo contiene el frente de tinte que indica el frente de migración de las muestras. Tanto la izquierda como la derecha deben contener un "marcador", que se utiliza como guía predecible de peso molecular.
Etiquete las muestras para cada carril. En la parte superior, las muestras agregadas a los pozos habrán migrado verticalmente en "carriles". Por lo tanto, todas las barras visibles en una columna vertical provienen de la única muestra cargada directamente encima de ella. Utilice la regla y el bolígrafo para poner bordes en los carriles si es difícil visualizar las columnas.
Etiquete los tamaños moleculares de las bandas en el carril marcador. Los marcadores disponibles comercialmente vienen con una imagen del patrón de banda esperado junto con los pesos moleculares de cada banda. Las bandas son las "barras" horizontales oscuras, que en realidad son proteínas teñidas incrustadas en el gel.
Dibuja líneas horizontales claras que se extiendan desde cada banda marcadora hasta el borde opuesto del gel. Tenga cuidado de hacer estas líneas paralelas a los pocillos y al frente del tinte. Estas líneas indican dónde se ubicarían en cada carril las proteínas del peso molecular indicado por cada una de las bandas marcadoras. Por ejemplo, una banda en el carril 4 que reside justo debajo de la línea que se extiende desde los 25 kilodalton la banda marcadora sugeriría que la banda del carril 4 tiene casi, pero no del todo, 25 kilodaltons en peso.
Etiquete cada banda en cada carril con su peso molecular estimado. Utilice los marcadores como guía y calcule los valores entre los tamaños de los marcadores.
Debajo de la fotografía del gel, haga una lista de "proteínas" para cada carril. Comience indicando lo que se sabe sobre cada muestra, como su origen o condiciones. Luego, enumere el peso molecular estimado de cada banda en el carril. Los carriles con una banda indican que la muestra contiene solo una proteína. Los carriles con múltiples bandas indican la presencia de múltiples proteínas. Las bandas que corren con el frente de migración son más pequeñas que las sugeridas por el marcador más cercano y probablemente no se pueden predecir excepto si son "más pequeñas" que lo que indica el marcador.
En la lista de proteínas, tenga en cuenta las rarezas. Una apariencia "manchada" puede indicar que hay demasiadas proteínas presentes o que la viscosidad de la muestra afectó su migración. Si las bandas parecen ir más allá del borde del carril o son bastante grandes en comparación con otras bandas, entonces es probable que la concentración de esa proteína sea demasiado alta y deba diluirse en el futuro electroforesis. Un tinte grisáceo en todo el carril, más oscuro que el color del gel de fondo, indica fragmentos de proteína indistinguibles.
Determine la identidad de las proteínas en cada carril. Aunque esto se hace usando solo el peso molecular, la fuente de cada carril probablemente también indicará pistas. Tenga en cuenta que, en algunas condiciones, las proteínas pueden mantener una asociación de dímero o trímero en un gel. Por lo tanto, una proteína puede aparecer en un gel como tres bandas distintas. Incluso si no se pueden identificar las proteínas, la oscuridad relativa de las bandas puede implicar las concentraciones de las proteínas en solución. Cualquier proteína curiosa y desconocida puede aislarse directamente del gel original y enviarse para su identificación.
Cosas que necesitará
- Fotografía de gel SDS-PAGE, teñido
- Clave para el marcador de peso molecular utilizado
- gobernante
- Bolígrafo