Ποιο είναι το πρώτο βήμα σε μια αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης;

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, ή η PCR, είναι μια τεχνική που αντιγράφει ένα θραύσμα DNA σε πολλά θραύσματα - εκθετικά πολλά. Το πρώτο βήμα είναι η PCR να θερμανθεί το DNA έτσι ώστε να μετουσιωθεί ή να λιώσει σε μονόκλωνα. Η δομή του DNA είναι σαν μια σκάλα σχοινιού στην οποία τα σκαλοπάτια είναι σχοινιά με μαγνητικά άκρα. Οι μαγνήτες συνδέονται για να σχηματίσουν τα σκαλοπάτια, που ονομάζονται ζεύγη βάσεων, και έτσι αντιστέκονται στο να απομακρυνθούν. Κάθε θραύσμα DNA τήκεται σε μονόκλωνα σε διαφορετικές θερμοκρασίες. Η κατανόηση του τρόπου με τον οποίο συγκρατείται η δομή του DNA από τα μεμονωμένα μέρη του DNA θα δώσει πληροφορίες για το γιατί διαφορετικά θραύσματα DNA λιώνουν σε διαφορετικές θερμοκρασίες και γιατί χρειάζονται τόσο υψηλές θερμοκρασίες στην πρώτη θέση.

Το πρώτο βήμα της PCR είναι η τήξη του DNA έτσι ώστε το δίκλωνο DNA να διαχωρίζεται σε μονόκλωνο DNA. Για το DNA των θηλαστικών, αυτό το πρώτο βήμα συνήθως περιλαμβάνει θερμότητα περίπου 95 βαθμούς Κελσίου (περίπου 200 Φαρενάιτ). Σε αυτήν τη θερμοκρασία, το υδρογόνο συνδέεται μεταξύ των ζευγών βάσης A-T και G-C ή σκαλοπατιών στη σκάλα DNA, διασπώνται, αποσυνδέοντας το διπλόκλωνο DNA. Ωστόσο, η θερμοκρασία δεν είναι αρκετά ζεστή για να σπάσει τη ραχοκοκαλιά φωσφορικού-σακχάρου που σχηματίζει τους απλούς κλώνους ή τους πόλους της σκάλας. Ο πλήρης διαχωρισμός των μονών κλώνων τους προετοιμάζει για το δεύτερο βήμα της PCR, το οποίο ψύχεται για να επιτρέψει σε σύντομα θραύσματα DNA, που ονομάζονται εναρκτήρες, να συνδέσουν τους απλούς κλώνους.

Ένας λόγος για τον οποίο το DNA θερμαίνεται στην υψηλή θερμοκρασία των 95 βαθμών Κελσίου είναι ότι όσο μεγαλύτερο είναι το διπλό σκέλος του DNA, τόσο περισσότερο θέλει να παραμείνει μαζί. Το μήκος του DNA είναι ένας παράγοντας που επηρεάζει το σημείο τήξης που έχει επιλεγεί για PCR σε αυτό το κομμάτι DNA. Οι βάσεις A-T και G-C συνδέονται μεταξύ τους στο δίκλωνο DNA δεσμό μεταξύ τους για να συγκρατούν τη δομή του διπλού κλώνου. Όσο περισσότερα συνεχόμενα ζεύγη βάσεων μεταξύ δύο μονών κλώνων έχουν συνδεθεί, τόσο περισσότερο θέλουν και οι γείτονές τους να συνδέονται και τόσο ισχυρότερη γίνεται η έλξη μεταξύ των δύο κλώνων. Είναι σαν φερμουάρ φτιαγμένο από μικρούς μαγνήτες. Καθώς κλείνετε το φερμουάρ, οι μαγνήτες θα θελήσουν φυσικά να φερμουάρ και να παραμείνουν φερμουάρ.

Ένας άλλος παράγοντας που επηρεάζει τη θερμοκρασία τήξης που πρέπει να επιλέξετε για το ενδιαφέρον κομμάτι DNA σας είναι η ποσότητα των ζευγών βάσεων G-C που υπάρχουν στο συγκεκριμένο τμήμα. Κάθε ζεύγος βάσης είναι σαν δύο μίνι μαγνήτες που προσελκύουν. Ένα ζεύγος από G και C προσελκύεται πολύ πιο έντονα από ένα ζεύγος Α και Τ. Έτσι, ένα κομμάτι DNA που έχει περισσότερα ζεύγη G-C από ένα άλλο θραύσμα θα απαιτήσει υψηλότερη θερμοκρασία πριν από την τήξη σε απλούς κλώνους. Το DNA απορροφά φυσικά το υπεριώδες φως - στο μήκος κύματος των 260 νανομέτρων, για να είναι ακριβές - και το μονόκλωνο DNA απορροφά περισσότερο φως από το διπλόκλωνο DNA. Έτσι, η μέτρηση της ποσότητας του φωτός που απορροφάται είναι ένας τρόπος μέτρησης του ποσού του δίκλωνου DNA σας που έχει λιώσει σε μονόκλωνα. Το φαινόμενο "μαγνητικό φερμουάρ" των ζευγών βάσεων G-C και A-T είναι αυτό που προκαλεί ένα γράφημα της απορρόφησης του φωτός δίκλωνο DNA σχεδίασε ενάντια σε μια αύξηση της θερμοκρασίας να είναι σιγμοειδής, να έχει σχήμα S και όχι ευθεία. Η καμπύλη του S αντιπροσωπεύει την αντίσταση της ομαδικής εργασίας που ασκούν τα ζεύγη βάσεων ενάντια στη θερμότητα επειδή δεν θέλουν να διαχωριστούν.

Η θερμοκρασία στην οποία ένα μήκος DNA λιώνει σε μονόκλωνα ονομάζεται θερμοκρασία τήξης, η οποία δηλώνεται με τη συντομογραφία «Tm». Αυτό υποδηλώνει τη θερμοκρασία στην οποία το μισό DNA σε ένα διάλυμα έχει λιώσει σε μονόκλωνα και το άλλο μισό εξακολουθεί να είναι σε διπλό κλώνο μορφή. Η θερμοκρασία τήξης είναι διαφορετική για κάθε θραύσμα DNA. Το DNA των θηλαστικών έχει περιεκτικότητα G-C 40%, που σημαίνει ότι το υπόλοιπο 60% των ζευγών βάσης είναι As και Ts. Η περιεκτικότητά του σε 40% G-C προκαλεί τήξη του DNA των θηλαστικών στους 87 βαθμούς Κελσίου (περίπου 189 Φαρενάιτ). Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο το πρώτο βήμα της PCR στο DNA των θηλαστικών είναι να θερμανθεί στους 94 βαθμούς Κελσίου (201 Φαρενάιτ). Μόνο επτά βαθμοί θερμότεροι από τη θερμοκρασία τήξης και όλοι οι διπλοί κλώνοι θα λιώσουν εντελώς σε μονόκλωνα.