Τι είναι το πάγωμα και γιατί είναι χρήσιμο στην κυτταρική βιολογία;

Οι κυτταρικές μεμβράνες αποτελούνται από φωσφολιπίδια και προσκολλημένες ή ενσωματωμένες πρωτεΐνες. Οι πρωτεΐνες των μεμβρανών παίζουν ζωτικούς ρόλους στο μεταβολισμό και τη ζωή του κυττάρου. Δεν μπορείτε να χρησιμοποιήσετε συνηθισμένη μικροσκοπία για να οπτικοποιήσετε ή να χαρακτηρίσετε πρωτεΐνες προσκόλλησης, μεταφορά πρωτεϊνών και πρωτεϊνικών καναλιών στην κυτταρική μεμβράνη. Χρησιμοποιώντας ηλεκτρονική μικροσκόπηση και μια τεχνική που ονομάζεται «κατάψυξη κατάψυξης», η οποία χωρίζει τις κατεψυγμένες κυτταρικές μεμβράνες, επιτρέπει την οπτικοποίηση της δομής της μεμβράνης και την οργάνωση των πρωτεϊνών μέσα στη θάλασσα φωσφολιπίδια Ο συνδυασμός άλλων μεθόδων με κατάψυξη κατάψυξης όχι μόνο μας βοηθά να κατανοήσουμε τη δομή των διαφόρων κυτταρικών μεμβρανών και πρωτεΐνες μεμβράνης, αλλά επιτρέπει την οπτικοποίηση και λεπτομερή ανάλυση της λειτουργίας συγκεκριμένων πρωτεϊνών, βακτηρίων και ιοί.

Χρησιμοποιώντας υγρό άζωτο, δείγματα βιολογικών ιστών ή κύτταρα καταψύχονται γρήγορα για να ακινητοποιήσουν τα κυτταρικά συστατικά. Οι κυτταρικές μεμβράνες αποτελούνται από δύο στρώματα φωσφολιπιδίων, που ονομάζονται διπλή στιβάδα, όπου οι υδρόφοβες ή υδρόφοβες ουρές λιπιδίων δείχνουν το εσωτερικό της μεμβράνης και τα υδρόφιλα άκρα του μορίου των λιπιδίων δείχνουν προς τα έξω και προς το εσωτερικό του κύτταρο. Το κατεψυγμένο δείγμα σπάει ή θραύεται με ένα μικρόσωμα, το οποίο είναι ένα εργαλείο που μοιάζει με μαχαίρι για την κοπή λεπτών φετών ιστού. Αυτό αναγκάζει την κυτταρική μεμβράνη να διαχωριστεί ακριβώς μεταξύ των δύο στρωμάτων επειδή η έλξη μεταξύ των υδρόφοβων ουρών λιπιδίων αντιπροσωπεύει το πιο αδύναμο σημείο. Μετά τη θραύση, το δείγμα υποβλήθηκε σε διαδικασία κενού, που ονομάζεται "παγώνοντας τη χάραξη". Η επιφάνεια του σπασμένου Το δείγμα σκιάζεται με ατμό άνθρακα και πλατίνας για να δημιουργηθεί ένα σταθερό αντίγραφο, το οποίο ακολουθεί το περίγραμμα του σπασίματος επίπεδο. Το οξύ χρησιμοποιείται για την πέψη οργανικού υλικού που προσκολλάται στο αντίγραφο, αφήνοντας ένα λεπτό κέλυφος πλατίνας της σπασμένης επιφάνειας της μεμβράνης. Αυτό το κέλυφος στη συνέχεια αναλύεται με ηλεκτρονική μικροσκοπία.

Η κατεψυγμένη χάραξη είναι η ξήρανση υπό κενό ενός μη σταθερού, κατεψυγμένου και καταψυγμένου βιολογικού δείγματος. Η διαδικασία ξήρανσης υπό κενό είναι παρόμοια με την κατάψυξη ξήρανσης φρούτων και λαχανικών που συσκευάζονται και πωλούνται σε παντοπωλεία. Χωρίς κατάψυξη, πολλές λεπτομέρειες της κυτταρικής δομής επισκιάζονται από κρυστάλλους πάγου. Το βήμα βαθιάς ή κατάψυξης βελτιώνει και επεκτείνει την αρχική μέθοδο κατάγματος κατάψυξης, επιτρέποντας την παρατήρηση των κυτταρικών μεμβρανών κατά τη διάρκεια διαφόρων δραστηριοτήτων. Επιτρέπει την ανάλυση όχι μόνο της δομής της μεμβράνης, αλλά και των ενδοκυτταρικών συστατικών και παρέχει λεπτομερείς δομικές πληροφορίες για βακτήρια, ιούς και μεγάλες κυτταρικές πρωτεΐνες συγκροτήματα.

Η ηλεκτρονική μικροσκοπία μπορεί να αποκαλύψει και να μεγεθύνει περισσότερο από ένα εκατομμύριο φορές τους μικρότερους οργανισμούς ή δομές, όπως βακτήρια, ιούς, ενδοκυτταρικά συστατικά και ακόμη και πρωτεΐνες. Η οπτικοποίηση δημιουργείται με βομβαρδισμό ενός εξαιρετικά λεπτού δείγματος με δέσμη ηλεκτρονίων. Οι δύο μέθοδοι μικροσκοπίας ηλεκτρονίων είναι η σάρωση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, ή SEM, και η ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης, ή ΤΕΜ. Τα δείγματα κατάγματος παγώματος αναλύονται τακτικά με TEM. Το TEM έχει καλύτερη ανάλυση από το SEM και προσφέρει δομικές πληροφορίες έως και 3 νανόμετρα αντιγράφων.

Η ανάπτυξη και η χρήση μικροσκοπίας ηλεκτρονίου κατάγματος κατάψυξης έδειξε ότι οι κυτταρικές μεμβράνες πλάσματος αποτελούνται από διπλοστιβάδες λιπιδίων και διευκρινίζουν πώς οργανώνονται οι πρωτεΐνες εντός των κυτταρικών μεμβρανών. Το κάταγμα κατάψυξης δίνει μια μοναδική εμφάνιση στο εσωτερικό των κυτταρικών μεμβρανών, επειδή χωρίζει και διαχωρίζει τα φωσφολιπίδια της μεμβράνης σε δύο αντίθετα και συμπληρωματικά φύλλα ή όψεις. Σε περισσότερα από 50 χρόνια από την εισαγωγή της πρώτης μηχανής κατάγματος κατάψυξης, η δημιουργία αντιγράφου πλατίνας εξακολουθεί να είναι ο μόνος τρόπος απόκτησης δομικών πληροφοριών σχετικά με την κυτταρική μεμβράνη. Η τεχνική δείχνει εάν συγκεκριμένες πρωτεΐνες επιπλέουν ή είναι αγκυρωμένες στην κυτταρική μεμβράνη, και εάν και πώς συσσωρεύονται ορισμένες πρωτεΐνες. Μια νεότερη μέθοδος - χρησιμοποιώντας αντισώματα που στοχεύουν συγκεκριμένες πρωτεΐνες - συνδυάζεται με κατάγματα κατάψυξης για τον εντοπισμό πρωτεϊνών και τη λειτουργία τους στην κυτταρική μεμβράνη.