Η ηλεκτροφόρηση πηκτής είναι μια μέθοδος που χρησιμοποιείται σε εργαστήρια για τη μέτρηση και ταξινόμηση κλώνων του DNA. Είναι απαραίτητο, επειδή το DNA υπό κανονικές συνθήκες είναι πολύ μικρό για χειρισμό, ακόμη και όταν προβάλλεται χρησιμοποιώντας τα περισσότερα μικροσκόπια. Το εργαστήριο ηλεκτροφόρησης πηκτής χρησιμοποιεί μια σχετικά απλή διαδικασία, και η ίδια βασική τεχνική μπορεί να χρησιμοποιηθεί και για τον διαχωρισμό μεμονωμένων πρωτεϊνών.
Το Gel Matrix
Για να ξεκινήσετε τη διαδικασία ηλεκτροφόρησης γέλης, πρέπει πρώτα να δημιουργήσετε το πήκτωμα. Συνήθως, οι πηκτές κατασκευάζονται σε λεπτά φύλλα χρησιμοποιώντας μια ουσία που ονομάζεται αγαρόζη. Η κονιοποιημένη αγαρόζη τοποθετείται σε φιάλη και ακολουθεί διάλυμα αλμυρού νερού που ονομάζεται ρυθμιστικό διάλυμα. Αυτό το μείγμα αγαρόζης και ρυθμιστικού θερμαίνεται έως ότου οι δύο ουσίες λιώσουν μεταξύ τους και στη συνέχεια χύνονται σε καλούπι σχηματισμού. Στη συνέχεια τοποθετείται μια συσκευή που ονομάζεται χτένα στο ένα άκρο του καλουπιού πριν κρυώσει το πήκτωμα. Όταν το πήκτωμα ψύχεται, η χτένα αφαιρείται, αφήνοντας μικρές σχισμές που θα χρησιμοποιηθούν για τη συγκράτηση δειγμάτων DNA.
Ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό του ψυγμένου μίγματος αγαρόζης (που ονομάζεται πλέγμα γέλης) προέρχεται από το γεγονός ότι δημιουργείται με αλμυρό νερό. Όταν ηλεκτριστεί, η μήτρα θα γίνει αγώγιμη, επιτρέποντας στην ηλεκτρική ενέργεια να ρέει κατά μήκος της. Μια άλλη ειδική ιδιότητα του πλέγματος πηκτής είναι η παρουσία κανονικών μικροσκοπικών οπών. Αυτές οι οπές θα επιτρέψουν σε κλώνους του DNA να διασχίσουν τη μήτρα γέλης και να διευκολύνουν τη διαδικασία ταξινόμησης.
Το θάλαμο ηλεκτροφόρησης
Το επόμενο βήμα σας είναι να δημιουργήσετε έναν θάλαμο ηλεκτροφόρησης. Πρόκειται για ένα μικρό ορθογώνιο κουτί, ενσύρματο με θετική και αρνητική ηλεκτρική σύνδεση και στα δύο άκρα. Οι θάλαμοι είναι συνήθως ρηχοί, αρκετά μικροί για να ταιριάζουν σε μια επιτραπέζια επιφάνεια και κατασκευασμένοι από καθαρά υλικά όπως το Plexiglas.
Το διάλυμα θαλασσινού νερού χύνεται στον πυθμένα του θαλάμου ηλεκτροφόρησης και η μήτρα πηκτής βυθίζεται ελαφρά μέσα σε αυτό το διάλυμα. Το αλμυρό νερό εξυπηρετεί δύο σκοπούς: βοηθώντας τη ροή του ηλεκτρικού ρεύματος και διατηρώντας την πηκτή ζεστή. Δεδομένου ότι το DNA προωθείται από αρνητικό φορτίο, τοποθετήστε τη μήτρα σας έτσι ώστε τα δείγματά σας να βρίσκονται δίπλα στην αρνητική ηλεκτρική σύνδεσή σας.
Προετοιμασία του DNA
Στη συνέχεια παρασκευάζονται δείγματα DNA. Δεδομένου ότι το DNA σε διάλυμα είναι σχεδόν αδύνατο να δει κανείς, ένας χρωστικός παράγοντας που ονομάζεται ρυθμιστικό φόρτωσης προστίθεται σε κάθε μεμονωμένο δείγμα. Αυτός ο παράγοντας πυκνώνει επίσης το διάλυμα DNA, καθιστώντας το λιγότερο τρέξιμο και πιο λειτουργικό. Χρησιμοποιώντας μια πιπέτα, μεταφέρετε ένα δείγμα διαλύματος DNA σε κάθε εναλλασσόμενη υποδοχή στη μήτρα γέλης. Στην κενή υποδοχή μεταξύ κάθε δείγματος, τοποθετήστε κάποια λύση DNA του οποίου το μήκος γνωρίζετε ήδη (ονομάζεται πρότυπο DNA) για έλεγχο και σύγκριση πειράματος.
Ενεργοποιήστε τη δύναμη
Τώρα, ενεργοποιήστε τον θάλαμο ηλεκτροφόρησης. Υπό αρνητική ισχύ, τα δείγματα DNA σας θα αναγκαστούν σε όλο το μήκος του θαλάμου. Μικροί κλώνοι του DNA θα μετακινηθούν πιο γρήγορα μέσω της μήτρας πηκτής και σε σύντομο χρονικό διάστημα θα διαχωριστούν από μακρύτερους, βραδύτερους κλώνους. Η βαφή στον χρωματικό παράγοντα σάς επιτρέπει να παρακολουθείτε το ίχνος του DNA. Δεν θα μπορείτε να δείτε μεμονωμένα σκέλη DNA, αλλά σκέλη του ίδιου μήκους θα συγκεντρωθούν.
Τελικά βήματα
Όταν το DNA διαχωρίζεται, η μήτρα αφαιρείται από τον θάλαμο ηλεκτροφόρησης. Το DNA στη συνέχεια χρωματίζεται για να επιτρέπει ευκολότερη μέτρηση και εξέταση.