DNA
Δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ και πρωτεΐνες. Το DNA οργανώνεται σε μονάδες που ονομάζονται γονίδια, καθεμία από τις οποίες κωδικοποιεί μια συγκεκριμένη αλληλουχία RNA ή πρωτεΐνης. Τα γονίδια μελετώνται για να μάθουν για τη βιολογική δομή και λειτουργία, την εξέλιξη, την ασθένεια και πολλές άλλες πτυχές των ζωντανών συστημάτων. Για να μελετηθούν λεπτομερώς τα γονίδια, το DNA πρέπει να απομονωθεί και να καθαριστεί από κύτταρα που ενδιαφέρουν.
Εκχύλιση DNA
Αν και το DNA από ένα μόνο κύτταρο μπορεί να εξαχθεί και να μελετηθεί, δεν αρκεί να το δούμε με γυμνό μάτι. Για να λάβετε επαρκή ποσότητα για την ουρά, τόσο περισσότερα κελιά πρέπει να εργαστείτε με τα καλύτερα (πολλά εκατομμύρια).
Τα ακριβή πρωτόκολλα διαφέρουν σημαντικά για να ληφθούν υπόψη τα μοναδικά χαρακτηριστικά συγκεκριμένων δειγμάτων, αλλά τα γενικά στάδια είναι η ομογενοποίηση, η λύση, η πέψη, ο διαχωρισμός και η συλλογή. Η διαδικασία πραγματοποιείται καλύτερα σε ένα μικρό (ανάλογα με το μέγεθος του δείγματος) γυάλινο ή πλαστικό σωλήνα.
Ένα δείγμα γενικά αναμιγνύεται ή αλέθεται για να διαχωρίσει πλήρως τα κύτταρα μεταξύ τους. Αυτό καθιστά τα συστατικά των κυττάρων πιο προσβάσιμα στα αντιδραστήρια που ακολουθούν. Στη συνέχεια προστίθενται απορρυπαντικό ή ένζυμα στο ομογενοποιημένο προϊόν για την λύση των κυτταρικών μεμβρανών (και των πυρηνικών μεμβρανών εάν τα κύτταρα είναι ευκαρυωτικά) για να απελευθερωθεί το DNA. Σε αυτό το σημείο, το DNA περιβάλλεται από πρωτεΐνες, λιπίδια, υδατάνθρακες οτιδήποτε άλλο περιέχεται στα κύτταρα.
Μια περαιτέρω ενζυματική πέψη μπορεί να είναι απαραίτητη για τη διάσπαση των πρωτεϊνών, ώστε να μην συνδέονται με το DNA και να παρεμβαίνουν στη συλλογή του. Το DNA διαχωρίζεται από το υπόλοιπο περιεχόμενο κυττάρου με προσθήκη ψυχρής, καθαρής, αιθυλικής ή ισοπροπυλικής αλκοόλης. Το DNA δεν είναι διαλυτό σε αυτές τις αλκοόλες, οπότε θα συμπυκνωθεί για να ελαχιστοποιηθεί η επαφή του με το αλκοόλ. Στη συνέχεια, τα συμπυκνωμένα DNA συλλέχθηκαν, συνήθως με φυγοκέντρηση ή πηνία.
Πηνία DNA
Η συλλογή DNA με πηνία είναι αποτελεσματική όταν λαμβάνεται μεγάλη ποσότητα DNA από μια διαδικασία εκχύλισης. Είναι επίσης μια εξαιρετική μέθοδος επίδειξης δεδομένου ότι μια εντυπωσιακή σύγχυση καθαρού DNA είναι σαφώς ορατή.
Για να τυλίξει το DNA, το βήμα διαχωρισμού πρέπει να πραγματοποιηθεί προσεκτικά. Εάν δεν ήταν μέρος του μίγματος αντιδραστηρίου λύσης που προστέθηκε προηγουμένως, ένα διάλυμα συμπυκνωμένου άλατος (χλωριούχο νάτριο) πρέπει να προστεθεί στο διάλυμα πριν από το στάδιο προσθήκης αλκοόλης. Η κρύα αλκοόλη χύνεται αργά κάτω από την πλευρά του δοκιμαστικού σωλήνα για να σχηματίσει ένα στρώμα πάνω από το υδατικό διάλυμα, αποφεύγοντας την ανάμιξη. Εάν γίνει σωστά, το αλκοόλ θα σχηματίσει το δικό του στρώμα πάνω από το αλμυρό στρώμα. Έπειτα έρχεται το καρούλι.
Για να συλλέξετε το DNA από το αλμυρό στρώμα, τοποθετήστε προσεκτικά μια γυάλινη ράβδο ανάδευσης μέσω του στρώματος αλκοόλης μέχρι να αγγίξει τον πυθμένα του σωλήνα. Περιστρέψτε αργά τη ράβδο μεταξύ των δακτύλων, ενώ παρακολουθείτε τη διεπαφή μεταξύ των δύο στρωμάτων. Εάν υπάρχει αρκετό DNA, θα συγκεντρωθεί στη διεπαφή μεταξύ των στρωμάτων για να σχηματίσει μια γαλακτώδη ημιδιαφανή μάζα. Περιστρέψτε τη ράβδο για να τυλίξετε το DNA γύρω από αυτό (δηλαδή το μέρος εκτύπωσης) και τραβήξτε το από το σωλήνα. Το DNA μπορεί να μεταφερθεί σε άλλο σωλήνα καθαρής αλκοόλης για αποθήκευση ή περαιτέρω ανάλυση.
