Ηλεκτροφόρηση γέλης είναι μια συχνά χρησιμοποιούμενη εργαστηριακή τεχνική με πολλές πρακτικές εφαρμογές, όπως αποτύπωση δακτυλικών αποτυπωμάτων DNA και αλληλουχία γονιδιώματος. Η διαδικασία περιλαμβάνει διαχωρισμό DNA θραύσματα που χρησιμοποιούν ηλεκτρικό ρεύμα ενώ παρακολουθούν τον ρυθμό μοριακής κίνησης μέσω πηκτής διήθησης.
Η προσθήκη μπλε ή πορτοκαλί χρωστικής παρακολούθησης σε άχρωμα δείγματα DNA σάς επιτρέπει να δείτε το δείγμα σας και να λάβετε πληροφορίες σχετικά με το πώς κινούνται τα μόρια DNA κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης. Η αναγνώριση βασίζεται στο μέγεθος των ταινιών DNA στο πήκτωμα μετά τη μετανάστευση των μορίων.
Πώς λειτουργεί η ηλεκτροφόρηση γέλης
Ηλεκτροφόρηση γέλης τραβά θραύσματα DNA μέσω γέλης χρησιμοποιώντας ηλεκτρικό ρεύμα για απομόνωση και αναγνώριση μορίων DNA κατά μέγεθος και ηλεκτρικό φορτίο. Το τζελ είναι συχνά κατασκευασμένο με σκόνη αγαρόζης - έναν πολυσακχαρίτη που εξάγεται από φύκι.
Αγαρόζη προστίθεται σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα νερού και αλατιού, και το μείγμα θερμαίνεται και ψύχεται για να σχηματίσει ένα πορώδες πήκτωμα που θα ενεργεί ως μήτρα φιλτραρίσματος κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ηλεκτροφόρησης. Το πήκτωμα στη συνέχεια τοποθετείται σε μια μονάδα ηλεκτροφόρησης και καλύπτεται με ρυθμιστικό διάλυμα που αγωνίζεται
Διαλύματα που περιέχουν DNA και βαφές φόρτωσης διοχετεύονται με πιπέτα σε μικρά φρεάτια στο πήκτωμα που πρέπει να παρασκευαστούν κατά την προετοιμασία της γέλης. Βαφέςνα σε βοηθήσωδείτε καθαρά το δείγμα ότι προσθέτετε στα φρεάτια γέλης που βρίσκονται κοντά στο αρνητικό ηλεκτρόδιο της μονάδας ηλεκτροφόρησης.
Ένα θετικό ηλεκτρόδιο βρίσκεται στο αντίθετο άκρο. Ένα πρώτο γνωστό πρότυπο θραυσμάτων DNA τοποθετείται στο πρώτο φρεάτιο που θα δημιουργήσει μια σκάλα ταινιών DNA για λόγους σύγκρισης και ταυτοποίησης.
Ο φωσφορικός σκελετός των μορίων DNA δίνει στο DNA αρνητικό φορτίο. Τα αντίθετα προσελκύουν, επομένως, τα μόρια DNA προσελκύονται στο θετικό ηλεκτρόδιο και αρχίζουν να κινούνται ή «μεταναστεύουν» όταν είναι ενεργοποιημένο ένα ηλεκτρικό ρεύμα.
Τα θραύσματα DNA μικρότερου μεγέθους ταξιδεύουν γρηγορότερα από τα μεγαλύτερα θραύσματα επειδή αντιμετωπίζουν λιγότερη αντίσταση καθώς μεταναστεύουν μέσω της πορώδους μήτρας του πηκτώματος. Θραύσματα DNA παρόμοιου μεγέθους σχηματίζουν ταινίες DNA στο πήκτωμα.
Φόρτωση Σκοπός και Σημασία της Βαφής
Το DNA είναι άχρωμο, προσθέτοντας έτσι βαφές παρακολούθησης σε ένα δείγμα σε βοηθάει καθορίστε το ρυθμό κίνησης μορίων πρωτεΐνης διαφορετικού μεγέθους στο πήκτωμα κατά την ηλεκτροφόρηση. Παραδείγματα φόρτωσης βαφών που κινούνται με το δείγμα DNA περιλαμβάνουν βρωμοφαινόλημπλε και ξυλόλη κυανόλη.
Η επιλεγμένη βαφή δεν πρέπει να είναι αντιδραστική ή να αλλοιώνει το DNA. Το μπλε της βρωμοφαινόλης είναι μια βαφή που χρησιμοποιείται για την παρακολούθηση κλώνων DNA μικρότερου μεγέθους που περιέχουν περίπου 400 ζεύγη βάσεων, ενώ η ξυλόλη κυανόλη είναι καλύτερη για μεγαλύτερους κλώνους DNA με έως και 8.000 ζεύγη βάσεων. Η επιλεγμένη βαφή δεν πρέπει να είναι αντιδραστική ή να αλλοιώνει το DNA.
Ο ρόλος της γλυκερίνης στην ηλεκτροφόρηση πηκτής αγκαρόζης
Όταν προετοιμάζετε το δείγμα DNA σας για ηλεκτροφόρηση, θα χρειαστεί να προσθέσετε γλυκερόλη και νερό μαζί με τη φόρτωση βαφών. Η γλυκερόλη είναι μια βαρύ, σιροπιανή ουσία που δίνει περισσότερη πυκνότητα στο δείγμα DNA προτού εισαχθεί στα φρεάτια στο ένα άκρο του φύλλου γέλης.
Χωρίς γλυκερίνη, το δείγμα DNA θα διασκορπίζεται αντί να βυθίζεται και να σχηματίζει ένα στρώμα στο πηγάδι όπως υποτίθεται ότι πρέπει να κάνει για να σχηματίσει μια σκάλα DNA.
Παρακολούθηση βαφής σε SDS PAGE
Η ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου θειικού νατρίου δωδεκυλίου (SDS PAGE) είναι μια τεχνική κατάλληλη για τον διαχωρισμό πρωτεϊνών και αμινοξέων, τα οποία είναι μικρότερα και πιο πολύπλοκα από τα γραμμικά μόρια DNA. Πολυακρυλαμίδιο (πήκτωμα SDS PAGE) χρησιμοποιείται αντί για γέλη αγαρόζης για ηλεκτροφόρηση.
Μπλε βρωμοφαινόλης (BPB) προστίθεται στο ρυθμιστικό δείγματος ως α βαφή παρακολούθησης που κινείται προς την ίδια κατεύθυνση του διαχωρισμού πρωτεϊνών και οριοθετεί το προβάδισμά τους.
Ο ρόλος της βαφής που δεσμεύει το DNA
Βαφή που δεσμεύει το DNA όπως πορτοκαλί βρωμιούχο αιθίδιο μπορεί να προστεθεί σε γέλη ή στο ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης. Όπως υποδηλώνει το όνομα, η βαφή προσκολλάται στο μόριο DNA.
Πρέπει να προσέχετε ιδιαίτερα όταν χειρίζεστε αυτήν τη μεταλλαξιογόνο βαφή επειδή μπορεί να προσκολληθεί στο DNA στα κύτταρα του δέρματος. Σε αντίθεση με τις βαφές παρακολούθησης, το βρωμιούχο αιθίδιο φθορίζει λαμπρά κάτω Φως UV, καθιστώντας τις ζώνες DNA ορατές.