Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα του Western Blot

Το στύπωμα Western, μια αναλυτική τεχνική που χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης σε ένα δεδομένο δείγμα, χρησιμοποιεί την ικανότητα ενός ενζύμου ή ενός πρωταρχικού αντισώματος σημασμένου με φθορισμό να συνδέεται με το συγκεκριμένο αντιγόνο του. Πρόκειται για μια διαδικασία τριών βημάτων που ξεκινά με ηλεκτροφόρηση γέλης, ακολουθούμενη από στύπωμα μεμβράνης και ανίχνευση με αντισώματα. Η ανίχνευση πρωτεϊνών μπορεί να είναι άμεση ή έμμεση, με το τελευταίο να χρησιμοποιεί ένα επισημασμένο δευτερογενές αντίσωμα που κατευθύνεται έναντι του πρωτογενούς. Αν και γίνεται αποδεκτή ως τεχνική ανάλυσης ρουτίνας πρωτεΐνης, το western blot έχει περιορισμούς καθώς και οφέλη.

Ένα από τα μεγαλύτερα επιχειρήματα υπέρ του western blot είναι η ευαισθησία του. Λόγω της ικανότητάς του να ανιχνεύει μόλις 0,1 νανογραμμάρια πρωτεΐνης σε ένα δείγμα, η τεχνική μπορεί θεωρητικά να χρησιμεύσει ως ένα αποτελεσματικό πρώιμο διαγνωστικό εργαλείο, που ανιχνεύει ακόμη και την παραμικρή ανοσογόνο απόκριση από έναν ιό ή βακτήρια σε έναν ασθενή δείγμα. Ένα έμμεσο στύπωμα western ενισχύει περαιτέρω αυτήν την ευαισθησία από την ικανότητα του δευτερεύοντος αντισώματος να ενισχύει την ένταση του σήματος που ανιχνεύεται από το σύστημα απεικόνισης. Μεγαλύτερη ευαισθησία σημαίνει ότι απαιτούνται λιγότερα αντισώματα για τον έλεγχο, γεγονός που μειώνει σημαντικά το εργαστηριακό κόστος.

Η τεχνική western blot οφείλει την ειδικότητά της σε δύο μεγάλους παράγοντες. Πρώτον, η ηλεκτροφόρηση γέλης ταξινομεί ένα δείγμα σε πρωτεΐνες διαφορετικού μεγέθους, φορτίου και διαμόρφωσης. Αυτή η διαδικασία από μόνη της είναι ένα τεράστιο βήμα προς την ανίχνευση, καθώς οι ζώνες που σχηματίζονται στο πήκτωμα δίνουν ήδη ενδείξεις για το μέγεθος της πρωτεΐνης ή του πολυπεπτιδίου που μας ενδιαφέρει. Η ειδικότητα της αλληλεπίδρασης αντισώματος-αντιγόνου χρησιμεύει ως ο δεύτερος μεγάλος παράγοντας. Επειδή συγκεκριμένα αντισώματα δείχνουν συγγένεια για συγκεκριμένες πρωτεΐνες, η διαδικασία μπορεί επιλεκτικά να ανιχνεύσει μια πρωτεΐνη στόχο ακόμη και σε ένα μείγμα 300.000 διαφορετικών πρωτεϊνών.

Παρά την ευαισθησία και την ιδιαιτερότητά του, μια κηλίδα western μπορεί ακόμα να παράγει λανθασμένα αποτελέσματα. Ένα ψευδώς θετικό αποτέλεσμα όταν ένα αντίσωμα αντιδρά με μια μη προοριζόμενη πρωτεΐνη, κάτι που συμβαίνει συχνά συμβαίνει όταν ένας ασθενής που δοκιμάζεται για HIV τυχαίνει να έχει φυματίωση ή έναν αριθμό παρασιτικών λοιμώξεις. Ένα ψευδώς αρνητικό, από την άλλη πλευρά, μπορεί εύκολα να προκύψει εάν οι μεγαλύτερες πρωτεΐνες δεν έχουν αρκετό χρόνο για να μεταφερθούν σωστά στη μεμβράνη. Η ακατάλληλη κηλίδωση και η επεξεργασία συχνά παράγουν λοξές, ξεθωριασμένες ή ακόμα και πολλαπλές ζώνες, καθιστώντας τα αποτελέσματα των δοκιμών υπόκεινται στην ερμηνεία του τεχνικού.

Το κόστος ενός στυπώματος western είναι μια σύνθεση των μεγάλων ατομικών δαπανών για επισημασμένα αντισώματα, ειδικευμένους αναλυτές και εργαστηριακό εξοπλισμό. Μια λεπτή διαδικασία, το στύπωμα western απαιτεί ακρίβεια σε κάθε βήμα για τη σωστή αναγνώριση των συστατικών του δείγματος. Ένα μικρό σφάλμα στη συγκέντρωση αντιδραστηρίου ή στην περίοδο επώασης μπορεί να είναι καταστροφικό για ολόκληρη τη διαδικασία. Τέλος, ο εξοπλισμός που απαιτείται για την ανίχνευση και την απεικόνιση - συστήματα ανίχνευσης χημειοφωταύγειας, φθορισμού, ραδιενεργού ή λέιζερ - μπορεί να είναι πολύ ακριβός για τη μέση μονάδα μικροβιολογίας.