Σύμφωνα με την ιστοσελίδα BioWeb του Πανεπιστημίου του Ουισκόνσιν, ένας εκκινητής PCR είναι ένα σύντομο, συνθετικό ολιγονουκλεοτίδιο (συνήθως μεταξύ 18 έως 25 βάσεις) χρησιμοποιείται για την ενίσχυση συγκεκριμένων περιοχών του DNA σε μια τεχνική μοριακής βιολογίας γνωστή ως αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Απαιτούνται τόσο εμπρόσθιο όσο και αντίστροφο αστάρι, σχεδιασμένο ώστε να είναι αντίστροφα συμπληρώματα του κλώνου DNA, για να πλευρίζει και να συνδέεται στην επιθυμητή περιοχή DNA. Όταν οι επιστήμονες θέλουν να πραγματοποιήσουν έρευνα σχετικά με ένα συγκεκριμένο γονίδιο ή περιοχή του DNA, πρέπει πρώτα να πραγματοποιήσουν PCR για να αποκτήσουν αρκετή περιοχή προορισμού για να εργαστούν. Ο σχεδιασμός αλληλουχιών εκκινητών για την περιοχή ενδιαφέροντος μπορεί να είναι απαραίτητος εάν δεν είναι ήδη διαθέσιμοι μέσω προηγούμενης δημοσιευμένης έρευνας ή με εμπορικά μέσα.
Αποκτήστε την αλληλουχία νουκλεοτιδίων του γονιδίου ή της περιοχής DNA που σας ενδιαφέρει και αποφασίστε πόσο καιρό ένα θραύσμα θέλετε να ενισχύσετε. Το εμπρόσθιο και αντίστροφο αστάρι έχει σχεδιαστεί ώστε να συνδέεται στην αρχή και στο τέλος του επιθυμητού θραύσματος. Συνήθως, οι συμβατικές μέθοδοι PCR χρησιμοποιούν εναρκτήρες που πλαισιώνουν μια περιοχή μήκους μεταξύ 100 έως 1.000 ζευγών βάσεων, ενώ οι μέθοδοι PCR σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιούν θραύσματα μήκους περίπου 50 έως 200 ζευγών βάσεων.
Αποφασίστε πού με τη σειρά θέλετε τα ψέματα. Για παράδειγμα, μπορεί να θέλετε την τοποθεσία κοντά στο 5 'ή το 3' άκρο της ακολουθίας ή στη μέση. Εάν είναι επιθυμητό, ορίστε τη θέση των εκκινητών ώστε να εκτείνεται σε ένα ιντρόνιο.
Σχεδιάστε αστάρια μήκους 18 έως 24 βάσεων. Βίνσεντ Ρ. Ο Prezioso, Ph. D., από την Brinkmann Instruments Inc., υποδηλώνει ότι αυτό το μήκος είναι αρκετά μεγάλο ώστε να είναι εξαιρετικά ειδικό για την επιθυμητή περιοχή DNA, αλλά αρκετά σύντομο ώστε να συνδέεται εύκολα (ανόπτηση). Η θερμοκρασία τήξης ασταριού (Tm) πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 55 και 80 βαθμών Κελσίου, αρκετά χαμηλή ώστε να επιτρέπει την πλήρη τήξη στους 90 βαθμούς Κελσίου ή μεγαλύτερη, αλλά αρκετά υψηλή ώστε να επιτρέπει την ανόπτηση. Το περιεχόμενο GC (ποσοστό Gs και Cs στη σειρά) πρέπει να είναι μεταξύ 40 και 60 τοις εκατό. Το 3 'άκρο της αλληλουχίας εκκινητή θα πρέπει να τελειώνει σε C ή G (που ονομάζεται σφιγκτήρας GC) για να προάγει τη δέσμευση, καθώς τα G και C τα νουκλεοτίδια έχουν ισχυρότερους δεσμούς, ωστόσο, αποφύγετε να έχετε τρία ή περισσότερα Gs ή Cs στις πέντε τελευταίες βάσεις της αλληλουχίας.
Αποφύγετε την εκτέλεση τεσσάρων ή περισσοτέρων από μία βάση (όπως ACCCC ...) ή τέσσερις ή περισσότερες επαναλήψεις δι-νουκλεοτιδίων (όπως ATATATAT ...) επειδή μπορεί να προκαλέσουν κακή προσθήκη. Σχεδιάστε αστάρια χωρίς ομολογία εντός του εκκινητή (περισσότερες από τρεις βάσεις που συμπληρώνουν τη μία το ίδιο το αστάρι) ή η ομολογία μεταξύ των εκκινητών (όπου το εμπρός και το αντίστροφο αστάρι έχουν συμπληρωματικά ακολουθίες). Αυτό μπορεί να προκαλέσει αυτοδιμερή ή διμερή εκκινητή, όπου οι εκκινητές συνδέονται με τους εαυτούς τους αντί να συνδέονται με την επιθυμητή αλληλουχία DNA.
Χρησιμοποιήστε διαδικτυακούς πόρους και ιστότοπους που βοηθούν στη σχεδίαση εκκινητών ή βοηθήστε στον έλεγχο αλληλουχιών εκκινητών για αυτοσυμπληρωματικότητα ή τη δυνατότητα δημιουργίας δευτερευόντων δομών όπως φουρκέτες. Ορισμένοι ιστότοποι σχεδιασμού εκκινητών περιλαμβάνουν το Primer3 του Ινστιτούτου Τεχνολογίας της Μασαχουσέτης, το Primer-Blast του Εθνικού Κέντρου Πληροφοριών Βιοτεχνολογίας και το OligoAnalyzer του Ολοκληρωμένου DNA Τεχνολογιών.