Το γενετικό σχεδιάγραμμα ενός κυττάρου κωδικοποιείται εντός του γενετικού του υλικού ή του DNA. Δεδομένου ότι το DNA δεν αφήνει ποτέ τον πυρήνα του κυττάρου, για να εισέλθουν αυτές οι πληροφορίες στο κυτταρόπλασμα όπου και άλλες υπάρχουν πρωτεΐνες και βιοχημικά συστατικά, είναι απαραίτητο να μεταγραφεί πρώτα το DNA σε messenger RNA (mRNA ή poly (Α) RNA). Αυτό το mRNA μεταφράζεται στη συνέχεια σε πρωτεΐνες που εκτελούν πολλές λειτουργίες του κυττάρου. Για την ανίχνευση ή τον ποσοτικό προσδιορισμό πολύ σπάνιων mRNA, την ανίχνευση μικροσυστοιχιών ή την κατασκευή βιβλιοθηκών συμπληρωματικών μορίων DNA, το mRNA πρέπει να απομονωθεί. Ωστόσο, η συνολική εκχύλιση RNA (δηλ. Όλο το RNA σε ένα κύτταρο) και η επακόλουθη απομόνωση mRNA δεν είναι αλληλοαποκλειόμενες διεργασίες. Το πρώτο πρέπει να εκτελεστεί για να εξαχθεί το mRNA.
Ομογενοποίηση TRIzol: Το συνολικό RNA περιλαμβάνει όλο το mRNA, το RNA μεταφοράς, το ριβοσωμικό RNA και άλλα μη κωδικοποιητικά RNA. Για να τα διαχωρίσετε από άλλα κυτταρικά συστατικά, το κελί ανοίγει πρώτα για να το αποδεσμεύσει περιεχόμενα. Αυτό γίνεται με επαναιώρηση των κυττάρων που σχηματίζονται σε σφαιρίδια με φυγοκέντρηση (περιστροφή σε υψηλές ταχύτητες) στο TRIzol Reagent (Life Technologies). Άλλες εκδόσεις του TRIzol (όπως το αντιδραστήριο TRI Ambion) λειτουργούν παρόμοια.
Ολική απομόνωση RNA: Μια σειρά φυγοκεντρισμών χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό των διαφόρων συστατικών (πρωτεΐνες, DNA, RNA) του κυττάρου σε στιβάδες ή φάσεις, εντός του εναιωρήματος. Η άνω, κίτρινη φάση αποτελείται από λίπος και μπορεί να απορριφθεί. Η επιθυμητή φάση είναι χρωματισμένη κόκκινη, περιέχει το συνολικό RNA και διατηρείται. Μετά την πραγματοποίηση εκχύλισης φαινόλης-χλωροφορμίου και μιας σειράς εκπλύσεων αλκοόλης χρησιμοποιώντας ισοπροπανόλη και αιθανόλη, το RNA μπορεί να συσσωματωθεί για απομόνωση mRNA. Προσθέστε αναστολείς RNase για να αποτρέψετε την αποικοδόμηση αυτού του ενζύμου του συνολικού RNA.
Εξαγωγή mRNA: Είναι σύνηθες να χρησιμοποιείτε κιτ για την απομόνωση mRNA, καθώς τα πρωτόκολλα σπιτικών εργαστηρίων δεν παράγουν μεγάλες ποσότητες πολύ καθαρισμένων mRNA. Τα εμπορικά κιτ περιλαμβάνουν το Invitrogen's FastTrack 2.0 ή το Ambion’s Poly (A) Pure mRNA Isolation Εργαλειοθήκη. Αυτά τα βασικά βήματα είναι κοινά σε τέτοια κιτ:
δ) Φυγοκεντρήστε αυτό το δείγμα και ανακτήστε το υπερκείμενο, το οποίο πλένεται αρκετές φορές σε μια σειρά ρυθμιστικών δεικτών και χαμηλού αλατιού που παρέχονται στα κιτ.
βιβλιογραφικές αναφορές
- "Πρωτόκολλα βιβλιοθήκης cDNA;"; Ίαν Γ. Cowell και Caroline A. Ώστιν; 1997
- "Πρωτόκολλα μεταγραφής και μετάφρασης In Vitro;"; Μάρτιν Τζ. Τιμς; 1995
Συμβουλές
- Κρατήστε όλα τα αντιδραστήρια, τα κύτταρα και το RNA κρύο βυθίζοντας σε πάγο. Αυτό αποτρέπει την αποικοδόμηση του RNA από οποιαδήποτε άλλα ένζυμα που απελευθερώνονται κατά τη διαδικασία ομογενοποίησης.
Προειδοποιήσεις
- Αντιδραστήρια όπως το TRIzol είναι τοξικά και δεν πρέπει να έρχονται σε επαφή με το δέρμα ή τους βλεννογόνους. Τηρείτε πάντα ασφαλή πρωτόκολλα εργαστηρίου κατά το χειρισμό αυτού του αντιδραστηρίου.
Σχετικά με τον Συγγραφέα
Ο Palmer Owyoung είναι κάτοχος Master of Arts σε διεθνείς επιχειρήσεις από το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια στο Σαν Ντιέγκο και α Πτυχίο Κοινωνιολογίας από το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια στη Σάντα Μπάρμπαρα και είναι εκπαιδευμένο μοριακό βιολόγος. Είναι ανεξάρτητος συγγραφέας από το 2006. Εκτός από το γράψιμο, είναι έμπορος Forex πλήρους απασχόλησης και έμπορος Διαδικτύου.
Φωτογραφικές μονάδες
Jupiterimages / Photos.com / Getty Images