In der Molekularbiologie kann eine gute Pufferauswahl und Vorbereitung für verschiedene DNA-Isolierungsschritte der Unterschied zwischen dem Übergang zur Proteinexpression oder dem Öffnen eines anderen Maxi-Prep-Kits, um zu beginnen Über. Trotz ihrer entscheidenden Bedeutung sind Pufferrezepte oft genau das – Rezepte, die ohne Erklärung oder Begründung für die verschiedenen Komponenten geschrieben wurden. Ein solcher Puffer ist Glucose-Tris-EDTA- oder GTE-Puffer.
Wofür wird GTE verwendet?
GTE wird verwendet, um Bakterienzellpellets zu resuspendieren, bevor die Zellen lysiert (aufgebrochen) und die darin enthaltene Plasmid-DNA geerntet werden. Lysozym, das die Zellmembranen aufweicht, wird oft zusammen mit dem GTE-Puffer hinzugefügt. Das Erreichen einer homogenen Suspension ganzer Zellen während dieses Schrittes, damit die anschließend zugegebene Lyselösung alle Zellen erreichen kann, ist der Schlüssel zu guten DNA-Ausbeuten. GTE ist darauf ausgelegt, dies zu tun und gleichzeitig eine stabile Umgebung für die DNA bereitzustellen.
Glucose für Osmolarität
50 mM (millimolar) Glukosezucker wird dem GTE-Puffer zugesetzt, um die Osmolarität aufrechtzuerhalten, wo die Konzentration des gelösten Stoffes außerhalb der Zellen nahe der innerhalb der Zellen liegt. Dies verhindert eine vorzeitige Zelllyse, die aufgrund von Aggregation und Abbau zu geringeren DNA-Ausbeuten führen kann. Die anderen Bestandteile des Puffers tragen ebenfalls zur Osmolarität der Lösung bei, aber Glucose, Da es kein Elektrolyt ist, ist es eine gute Wahl, da es den Puffer der Lösung nicht stört Eigenschaften.
Tris für pH-Stabilität
Tris ist die Kurzbezeichnung für Tris(hydroxymethyl)aminomethan, ein sehr verbreiteter pH-Puffer. Im Fall von GTE-Puffer wird dem Puffer das Säuresalz (Tris-HCl) in einer Konzentration von 25 mM zugesetzt. Dadurch wird der pH-Wert der Lösung bei nahezu physiologischen 8,0 gehalten, einem idealen pH-Wert, um eine saure Hydrolyse (Zersetzung) der Plasmid-DNA und unerwünschte Nebenreaktionen der anderen Zellkomponenten zu verhindern.
EDTA verhindert DNA-Abbau
EDTA oder Ethylendiamintetraessigsäure fängt oder "chelatiert" Metallionen aus der Lösung und verhindert, dass sie an unerwünschten Nebenreaktionen teilnehmen. In GTE-Puffer wird EDTA mit 10 mM zugegeben. Sein Hauptzweck besteht darin, im Puffer freies Zink, Magnesium und Kalzium aufzurunden, wodurch der DNA-Abbau durch bestimmte Wege verhindert wird, die diese Metalle benötigen.
Einige wichtige Tipps
Halten Sie Ihren GTE-Puffer kalt und stellen Sie ihn in kleinen Mengen her, um das Wachstum von unbeabsichtigten Bakterien darin zu verhindern. Zucker und der kontrollierte pH-Wert sorgen für ein großartiges Wachstumsmedium. Verwenden Sie immer gereinigtes Wasser. Leitungswasser kann einen Überschuss an Metallionen aus den Rohren enthalten, was die Aufnahmefähigkeit des EDTA überfordern kann. Wenn Sie das Vorhandensein von störender RNA in Ihrer Probe vermuten, fügen Sie Ihrem GTE-Puffer 100 Mikrogramm pro Milliliter RNase A hinzu, um das Problem zu beseitigen.