Biochemiker und Molekularbiologen verwenden Elektrophorese, um Makromoleküle wie Proteine und Nukleinsäuren zu trennen. Dadurch können Wissenschaftler einzelne Proteine oder Nukleinsäuresequenzen in einem komplexen Gemisch isolieren und analysieren. Ein typisches Beispiel für Elektrophorese im Labor ist ein Mikrobiologe, der die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet, um DNA-Fragmente zu trennen, die in einer mikrobiellen Gemeinschaft produziert werden. Unabhängig vom Zweck erfordert die Elektrophorese immer die Verwendung einer Pufferlösung.
TL; DR (zu lang; nicht gelesen)
Elektrophorese trennt Makromoleküle wie Protein und Nukleinsäuren nach Größe, Ladung und anderen Eigenschaften. Für Elektrophorese, die nach Ladung trennt, verwenden Wissenschaftler Puffer, um diese Ladung durch das Gel zu übertragen. Puffer hält das Gel auch auf einem stabilen pH-Wert und minimiert Veränderungen, die im Protein oder der Nukleinsäure auftreten könnten, wenn es einem instabilen pH-Wert ausgesetzt wird.
Prinzipien der Elektrophorese
Elektrophorese trennt Moleküle entlang eines Gradienten basierend auf ihrer Größe, Ladung oder anderen Eigenschaften. Dieser Gradient kann ein elektrisches Feld sein oder, im Fall der denaturierenden Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE), ein Denaturierungsmittel wie eine Mischung aus Harnstoff und Formamid. Proteine wandern bei negativer Ladung zur Anode und bei positiver Ladung zur Kathode. Da größere Moleküle langsamer wandern als kleinere Moleküle, können Wissenschaftler die zurückgelegte Strecke messen und logarithmen verwenden, um die Größe der Fragmente zu bestimmen.
Denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese
Bei DGGE bewegt sich die DNA entlang eines Gradienten zunehmender Denaturierungskraft, bis die Kraft ausreicht, um dieses bestimmte DNA-Fragment vollständig zu denaturieren oder zu entfalten. An diesem Punkt wird die Migration beendet. Wissenschaftler können diese Methode nutzen, um Fragmente basierend auf ihrer individuellen Anfälligkeit für Denaturierung zu trennen.
Was der Puffer tut
Bei der ladungsgetrennten Elektrophorese übertragen Ionen im Puffer die zur Trennung notwendige Ladung. Der Puffer hält auch den pH-Wert in einem engen Bereich, indem er ein Reservoir für schwache Säuren und Basen bereitstellt. Dies ist wichtig, da sich Struktur und Ladung eines Proteins oder einer Nukleinsäure ändern, wenn es signifikanten pH-Änderungen ausgesetzt wird, wodurch eine ordnungsgemäße Trennung verhindert wird.
Typische Puffer
Verschiedene Puffer sind ideal, um das Elektrophoresegel in verschiedenen gewünschten pH-Bereichen zu halten. Typische Puffer, die Wissenschaftler hierfür verwenden, sind Essigsäure, Borsäure, Phosphorsäure und Zitronensäure sowie Glycin und Taurin. Im Allgemeinen sollte der pKa-Wert (Säuredissoziationskonstante) nahe dem erforderlichen pH-Wert liegen. Es ist vorzuziehen, Puffer zu verwenden, die eine geringe Ladungsgröße bereitstellen, um nicht zu viel Strom zu leiten.
