DNA-kloning: Definition, proces, eksempler

Det er muligt at klone hele organismer som fåret Dolly, men DNA-kloning er anderledes. Det bruger molekylærbiologiske teknikker til at fremstille identiske kopier af DNA-sekvenser eller enkeltgener.

Ved hjælp af gentekniske metoder identificeres og isoleres segmenter af DNA-genetisk kode. DNA-kloning kopierer derefter nukleinsyre sekvenser i segmenterne.

De resulterende identiske kopier kan bruges til yderligere forskning eller til bioteknologiske applikationer. Ofte koder genet, der kopieres, for et protein, der kan udgøre en del af medicinske behandlinger. DNA-teknologi inklusive DNA-kloning understøtter forståelsen af, hvordan gener fungerer, og hvordan menneskers genetiske kode påvirker kroppens funktion.

DNA-kloning er den molekylærbiologiske proces til fremstilling af identiske kopier af DNA-segmenter placeret i kromosomerne, der indeholder den genetiske kode for avancerede organismer.

Processen genererer store mængder af målrette DNA-sekvenser

De to metoder, der anvendes i DNA-kloning, kaldes plasmidvektor og polymerasekædereaktion (PCR). I plasmidvektor metode skæres DNA-tråde ved hjælp af restriktionsenzymer for at producere DNA-fragmenter, og de resulterende segmenter indsættes i kloningsvektorer kaldet plasmider til yderligere duplikering. Plasmiderne placeres i bakterieceller, der derefter producerer DNA-kopierne eller kodede proteiner.

I PCR-metode, er segmentet af DNA-tråde, der skal duplikeres, markeret med kaldte enzymer primere. Et polymeraseenzym fremstiller kopier af den markerede del af DNA-strengen. Denne metode bruger ikke restriktionsenzymer og kan producere klonet DNA fra små prøver. Nogle gange bruges de to DNA-teknologimetoder sammen til at inkorporere de bedste funktioner i hver i en samlet reaktion.

Metodens vektor refererer til det plasmid, der anvendes til at holde det mål-DNA-segment, der skal klones. Plasmider er små cirkulære tråde af ikke-kromosomalt DNA findes i mange organismer, herunder bakterier og vira.

Bakterielle plasmider er den vektor, der anvendes til at indsætte mål-DNA-segmentet i bakterieceller til yderligere duplikering.

Valg og isolering af mål-DNA: Inden DNA-kloningsprocessen kan begynde, skal DNA-sekvenserne identificeres, især begyndelsen og enderne af DNA-segmenterne.

Sådanne DNA-sekvenser kan findes ved anvendelse af eksisterende klonet DNA med kendte sekvenser eller ved at studere proteinet produceret af mål-DNA-sekvensen. Når først sekvensen er kendt, kan de tilsvarende restriktionsenzymer anvendes.

Skæring af mål-DNA'et med restriktionsenzymer: Restriktionsenzymer vælges for at lede efter DNA-koden i begyndelsen og slutningen af ​​målsekvenserne.

Når restriktionsenzymerne finder en speciel kodet sekvens af basepar kaldet restriktionssteder, gør de det knytte sig til DNA'et på dette sted og vikle sig rundt DNA-molekylet og adskille DNA'et strand. De udskårne DNA-segmenter, der indeholder målsekvensen, er nu tilgængelige til duplikering.

Valg af plasmidvektor og indsættelse af mål-DNA: Et passende plasmid indeholder ideelt de samme DNA-kodende sekvenser som DNA-strengen, hvorfra mål-DNA'et blev skåret. Den cirkulære DNA-streng i plasmidet skæres med de samme restriktionsenzymer som blev brugt til at skære mål-DNA'et.

EN DNA ligase enzym anvendes til at fremme DNA-segmentbinding, og enderne af mål-DNA-segmentet binder sig sammen med de skårne ender af plasmid-DNA'et. Mål-DNA'et udgør nu en del af den cirkulære plasmid-DNA-streng.

Indsættelse af plasmidet i en bakteriecelle: Når plasmidet indeholder den DNA-sekvens, der skal klones, kan den faktiske kloning finde sted ved hjælp af en proces kaldet bakteriel transformation. Plasmiderne indsættes i en bakteriecelle såsom E. coli, og cellerne med de nye DNA-segmenter begynder at producere kopier og de tilsvarende proteiner.

I bakteriel transformation inkuberes værtscellerne og plasmiderne sammen ved kropstemperatur i ca. 12 timer. Cellerne absorberer nogle af plasmiderne og behandler dem som deres eget plasmid-DNA.

Høstning af klonet DNA og proteiner: De fleste plasmider anvendt til DNA-kloning har gener mod antibiotikaresistens indarbejdet i deres DNA. Da bakteriecellerne absorberer de nye plasmider, bliver de resistente over for antibiotika.

Når kulturen behandles med antibiotika, overlever kun de celler, der har absorberet de nye plasmider. Resultatet er en ren kultur af bakterieceller med klonet DNA. Dette DNA kan derefter høstes, eller det tilsvarende protein kan produceres.

Det PCR metoden er enklere og kopierer eksisterende DNA på plads. Det kræver ikke skæring med restriktionsenzymer eller indsættelse plasmidDNA sekvenser. Dette gør det særligt velegnet til kloning af DNA-prøver med et begrænset antal DNA-tråde. Mens metoden kan klone DNA, kan den ikke bruges til produktion af det tilsvarende protein.

Afvikling af DNA-strengene: DNA i kromosomer er tæt viklet i en dobbelt helixstruktur. Opvarmning af DNA til 96 grader Celsius i en proces, der kaldes denaturering gør DNA-molekylet uncoil og adskilles i to tråde. Denne adskillelse er påkrævet, fordi kun en enkelt DNA-streng kan klones ad gangen.

Valg af primere: Som med plasmidvektor-DNA-kloning skal de DNA-sekvenser, der skal klones, identificeres med særlig vægt på begyndelsen og enderne af DNA-segmenterne. Primere er enzymer, der binder til specifikke DNA-kodesekvenser, og de skal vælges for at markere mål-DNA-segmenterne. De rigtige primere fastgøres til DNA-molekylsekvenserne for at markere begyndelsen og slutningen af ​​målsegmenterne.

Annealing reaktionen for at binde primerne: Køling af reaktionen ned til ca. 55 grader Celsius kaldes udglødning. Når reaktionen afkøles, aktiveres primerne og binder sig til DNA-strengen i hver ende af et mål-DNA-segment. Primerne fungerer kun som markører, og DNA-strengen behøver ikke at blive skåret.

Producerer identiske kopier af mål-DNA-segmentet: I en proces kaldet udvidelsetilsættes det varmefølsomme TAQ-polymeraseenzym til reaktionen. Reaktionen opvarmes derefter til 72 grader Celsius, hvilket aktiverer enzymet. Det aktive DNA-polymeraseenzym binder til primerne og kopierer DNA-sekvensen mellem dem. Den indledende DNA-sekventering og kloning er fuldført.

Forøgelse af udbyttet af klonet DNA: Den indledende annealing- og forlængelsesproces skaber relativt få kopier af de tilgængelige DNA-strengesegmenter. For at øge udbyttet gennem yderligere DNA-replikation afkøles reaktionen igen for at genaktivere primerne og lade dem binde til andre DNA-tråde.

Derefter aktiverer reaktionsopvarmningen igen polymeraseenzymet, og der produceres flere kopier. Denne cyklus kan gentages 25 til 30 gange.

Plasmidvektormetoden er afhængig af en rigelig indledende tilførsel af DNA til at skære og indsætte i plasmider. For lidt originalt DNA resulterer i færre plasmider og en langsom start af klonet DNA-produktion.

PCR-metoden kan producere en stor mængde DNA fra få originale DNA-tråde, men fordi DNA ikke implanteres i en bakteriecelle, er proteinproduktion ikke mulig.

For at producere proteinet kodet i DNA-fragmenterne, der skal klones fra en lille indledende DNA-prøve, kan de to metoder bruges sammen, og de kan supplerer hinanden. Først bruges PCR-metoden til at klone DNA fra en lille prøve og producere mange kopier.

Derefter anvendes PCR-produkterne med plasmidvektormetoden til at implantere det producerede DNA i bakterieceller, der vil producere det ønskede protein.

Molekylærbiologi bruger genkloning og DNA-replikation til medicinske og kommercielle formål. Bakterierne med klonede DNA-sekvenser bruges til at producere medicin og erstatte stoffer, som mennesker med genetiske lidelser ikke selv kan producere.

Typiske anvendelser inkluderer:

• Genet til humant insulin klones i bakterier, der derefter producerer det insulin, der anvendes af diabetikere.
• Vævsplasminogenaktivator produceres af klonet DNA og bruges til at hjælpe forhindre blodpropper.
• Humant væksthormon kan produceres og administreres til mennesker, der ikke selv kan producere det.

Bioteknologi bruger også genkloning i landbruget til at skabe nye egenskaber hos planter og dyr eller forbedre eksisterende egenskaber. Efterhånden som flere gener klones, øges antallet af mulige anvendelser eksponentielt.

DNA-molekyler udgør en lille brøkdel af materialet i en levende celle, og det er svært at isolere indflydelsen fra de mange gener. DNA-kloningsmetoderne leverer store mængder af en specifik DNA-sekvens til undersøgelse, og DNA'et producerer proteiner, ligesom det gjorde i den oprindelige celle. DNA-kloning gør det muligt at studere denne operation for forskellige gener isoleret.

Typiske anvendelser inden for forskning og DNA-teknologi inkluderer undersøgelse af:

• Genets funktion.
• Mutationer af et gen.
• Genekspression.
• Genprodukter.
• Genetiske defekter.

Når flere DNA-sekvenser klones, er det lettere at finde og klone yderligere sekvenser. De eksisterende klonede DNA-segmenter kan bruges til at bestemme, om et nyt segment matcher det gamle, og hvilke dele der er forskellige. Identifikation af en mål-DNA-sekvens er derefter hurtigere og mere præcis.

I genterapi, præsenteres et klonet gen for cellerne i en organisme, hvis naturlige gen er beskadiget. Et vitalt gen, der producerer et protein, der kræves til en bestemt organisme, kan muteres, ændres ved stråling eller påvirkes af vira.

Når genet ikke fungerer korrekt, mangler der et vigtigt stof i cellen. Genterapi forsøger at udskift genet med en klonet version, der producerer det krævede stof.

Genterapi er stadig eksperimentel, og få patienter er blevet helbredt ved hjælp af teknikken. Problemerne ligger i at identificere det enkelte gen, der er ansvarlig for en medicinsk tilstand, og at levere mange kopier af genet til de rigtige celler. Da DNA-kloning er blevet mere udbredt, er genterapi blevet anvendt i flere specifikke situationer.

Seneste succesrige applikationer har inkluderet:

• Parkinsons sygdom: Ved hjælp af en virus som en vektor blev et Parkinsons-sygdomsrelateret gen injiceret i mellemhulerne hos patienter. Patienter oplevede forbedrede motoriske færdigheder uden uønskede bivirkninger.
• Adenosindeaminase (ADA) -mangel: En genetisk immunforstyrrelse blev behandlet ved at fjerne patienters blodstamceller og indsætte ADA-genet. Patienterne var i stand til at producere i det mindste noget af deres egen ADA som et resultat.
• Hæmofili: Mennesker med hæmofili producerer ikke specifikke proteiner, der hjælper blodpropper. Et gen til produktion af et af de manglende proteiner blev indsat i levercellerne hos patienter. Patienter producerede proteinet og blødningshændelser blev reduceret.

Genterapi er en af ​​de mest lovende anvendelser af DNA-kloning, men andre nye anvendelser vil sandsynligvis sprede sig, når flere DNA-sekvenser undersøges, og deres funktion bestemmes. DNA-kloning leverer råmaterialet til genteknologi i de nødvendige mængder.

Når genernes rolle er kendt, og deres korrekte funktion kan sikres ved udskiftning af defekt gener, mange kroniske sygdomme og endda kræft kan angribes og behandles på et genetisk niveau ved hjælp af DNA teknologi.

Relateret indhold:

• Koloniegenskaber for E.Coli (Escherichia Coli)
• RNA: Definition, funktion, struktur