Western blot, en analytisk teknik, der anvendes til at lokalisere et specifikt protein i en given prøve, anvender et enzyms eller fluorescensmærkede primære antistofs evne til at binde til dets specifikke antigen. Det er en tretrins proces, der begynder med gelelektroforese, efterfulgt af membranblotting og sondering med antistoffer. Proteindetektion kan være direkte eller indirekte, hvor sidstnævnte anvender et mærket sekundært antistof rettet mod det primære. Selvom det accepteres som en rutinemæssig proteinanalyseteknik, har Western blot begrænsninger såvel som fordele.
Fordel: Følsomhed
Et af de største argumenter for western blot er dets følsomhed. På grund af dets evne til at detektere så lidt som 0,1 nanogram protein i en prøve kan teknikken teoretisk tjene som et effektivt tidligt diagnostisk værktøj, der registrerer selv det mindste immunogene respons fra en virus eller bakterier hos en patient prøve. En indirekte western blot bygger videre på denne følsomhed fra det sekundære antistofs evne til at forstærke intensiteten af signalet detekteret af billeddannelsessystemet. Større følsomhed betyder, at der er behov for færre antistoffer til test, hvilket reducerer laboratorieomkostningerne betydeligt.
Fordel: Specificitet
Western blot-teknikken skylder sin specificitet to store bidragende faktorer. For det første sorterer gelelektroforese en prøve i proteiner af forskellig størrelse, ladning og konformation. Denne proces er i sig selv et stort skridt mod påvisning, da bånd dannet i gelen allerede giver spor om størrelsen af proteinet eller polypeptidet af interesse. Specificiteten af antistof-antigen-interaktionen tjener som den anden store faktor. Da specifikke antistoffer viser affinitet for specifikke proteiner, kan processen selektivt detektere et målprotein, selv i en blanding af 300.000 forskellige proteiner.
Ulempe: tilbøjelige til falske eller subjektive resultater
På trods af dets følsomhed og specificitet kan en western blot stadig give fejlagtige resultater. Et falsk-positivt resultat, når et antistof reagerer med et ikke-bestemt protein, hvilket ofte er det sker, når en patient, der testes for hiv, tilfældigvis har tuberkulose eller et antal parasitære infektioner. Et falsk-negativt kan derimod let resultere, hvis større proteiner ikke får tilstrækkelig tid til at overføre ordentligt til membranen. Forkert blotting og behandling producerer ofte skæve, falmede eller endda flere bånd, hvilket gør testresultaterne underlagt fortolkningen af teknikeren.
Ulempe: Høj pris og teknisk efterspørgsel
Omkostningerne ved en western blot er en sammensætning af de store individuelle udgifter til mærkede antistoffer, dygtige analytikere og laboratorieudstyr. En delikat proces, western blotting kræver præcision i hvert trin for korrekt identifikation af en prøves bestanddele. En mindre fejl i reagenskoncentration eller i inkubationsperioden kan være katastrofal for hele processen. Endelig kan det nødvendige udstyr til påvisning og billeddannelse - kemiluminescerende, fluorescerende, radioaktive eller laserdetekteringssystemer - være for dyrt for den gennemsnitlige mikrobiologiske enhed.