I molekylærbiologi kan godt buffervalg og forberedelse til forskellige DNA-isoleringstrin være forskellen mellem at gå over til proteinekspression eller åbne et andet maxi-prep kit for at starte over. På trods af deres afgørende betydning er bufferopskrifter ofte netop det - opskrifter skrevet uden forklaring eller begrundelse for de forskellige komponenter. En sådan buffer er glucose-tris-EDTA eller GTE-buffer.
Hvad bruges GTE til?
GTE bruges til at resuspendere bakteriecellepellets inden lysering (åbning) af cellerne og høstning af plasmid-DNA indeni. Lysozym, som blødgør cellemembranerne, tilsættes ofte sammen med GTE-bufferen. At opnå en homogen suspension af hele celler under dette trin, så den efterfølgende tilsatte lysisopløsning kan komme til alle cellerne, er nøglen til at få gode DNA-udbytter. GTE er designet til at gøre dette, samtidig med at det giver et stabilt miljø for DNA'et.
Glukose til osmolaritet
50 mM (millimolar) glukose sukker tilsættes til GTE-buffer for at opretholde osmolaritet, hvor koncentrationen af opløst stof uden for cellerne er tæt på den inden i cellerne. Dette forhindrer for tidlig cellelyse, som kan forårsage lavere DNA-udbytter på grund af aggregering og nedbrydning. De andre komponenter i bufferen bidrager også til opløsningens osmolaritet, men glucose, at være en ikke-elektrolyt, er et godt valg, fordi det ikke forstyrrer løsningens buffer ejendomme.
Tris for pH-stabilitet
Tris er det korte navn for tris (hydroxymethyl) aminomethan, som er en meget almindelig pH-buffer. I tilfælde af GTE-buffer tilsættes syresaltet (Tris-HCI) til bufferen i en koncentration på 25 mM. Dette opretholder opløsningens pH ved en næsten fysiologisk 8,0, en ideel pH til forhindring af syrehydrolyse (nedbrydning) af plasmid-DNA'et og uønskede sidereaktioner af de andre cellekomponenter.
EDTA forhindrer DNA-nedbrydning
EDTA eller ethylendiamintetraeddikesyre fanger eller "chelaterer" metalioner ud af opløsning, hvilket forhindrer dem i at deltage i uønskede sidereaktioner. I GTE-buffer tilføjes EDTA ved 10 mM. Dets primære formål er i bufferen at afrunde frit zink, magnesium og calcium og derved forhindre DNA-nedbrydning ved visse veje, der kræver disse metaller.
Nogle vigtige tip
Hold din GTE-buffer kold og lav den i små mængder for at forhindre vækst af utilsigtede bakterier i den. Sukker og den kontrollerede pH giver et godt vækstmedium. Brug altid renset vand. Vand fra hanen kan have et overskud af metalioner fra rørene, hvilket kan overvælde EDTA's evne til at fange. Hvis du har mistanke om tilstedeværelsen af interfererende RNA i din prøve, skal du tilføje RNase A med 100 mikrogram pr. Milliliter til din GTE-buffer for at eliminere problemet.