Spektrofotometri er et uvurderligt værktøj inden for kemi og biologi. Grundideen er enkel: forskellige stoffer absorberer lys / elektromagnetisk stråling bedre ved nogle bølgelængder end andre. Derfor er nogle materialer gennemsigtige, mens andre f.eks. Er farvede. Når du skinner lys af en given bølgelængde gennem en opløsning, jo højere koncentration, jo mere lys absorberer den. For at beregne koncentrationen skal du sammenligne din læsning med aflæsninger for standarder for kendt koncentration. Proceduren nedenfor er en temmelig generisk procedure skrevet med et kemilæringslaboratorium i tankerne, men det kan også ændres til andre indstillinger.
Som altid, når du arbejder i et laboratorium, skal du iføre dig beskyttelsesbriller, handsker og langærmet frakke for at sikre din egen sikkerhed.
Klem gummipæren for at tømme den for luft, placer den oven på din graduerede pipette, og lad pæren slappe af, så den suger vand op i pipetten. Fjern derefter pæren, og hæt toppen af pipetten med din finger; dette forsegler pipetten, så opløsningen indeni ikke strømmer ud, før din finger er fjernet. Løft kanten af din finger let for at lade en lille opløsning strømme ud af pipetten, indtil du når det ønskede volumen. Øv med lidt vand og et bægerglas for at få en fornemmelse for, hvordan den graduerede pipette fungerer. Linket under afsnittet Ressourcer har et filmklip, der viser dig, hvordan du bruger en pipette, hvis du aldrig har arbejdet med en før.
Mærk 5 reagensglas som standard 1-5. Du kan mærke dem ved hjælp af maskeringstape og en pen eller ved hjælp af en tør sletningsmarkør.
Vælg fem koncentrationer til dine standarder. Du vil have, at standardkoncentrationerne skal adskilles fra hinanden med omtrent det samme interval - f.eks. 0,1 molar, 0,2 molar, 0,3 molar osv. - og i omtrent samme rækkevidde som hvad du forventer, at din ukendte vil være. Brug indtil videre følgende fem koncentrationer, men husk at du bliver nødt til at ændre disse, når du udfører dit eget eksperiment:
Standard 1: 0,1 molær Standard 2: 0,2 molar Standard 3: 0,3 molar Standard 4: 0,4 molar Standard 5: 0,5 molar
Tag derefter 1 molær standardopløsning og tilsæt følgende mængder til reagensglas 1-5. Husk, at disse beløb beregnes ved hjælp af de ovenfor anførte koncentrationer, så du bliver muligvis nødt til at ændre dem efter behov, når du udfører dit eget eksperiment.
Standard 1: 0,8 milliliter Standard 2: 1,6 milliliter Standard 3: 2,4 milliliter Standard 4: 3,2 milliliter Standard 5: 4 milliliter
Skyl den graduerede pipette, og overfør derefter følgende mængder deioniseret vand:
Standard 1: 7,2 milliliter Standard 2: 6,4 milliliter Standard 3: 5,6 milliliter Standard 4: 4,8 milliliter Standard 5: 4,0 milliliter
Grundlæggende er ideen at bringe mængden af opløsning i hvert rør op til 8 ml.
Dæk hvert af standardrørene med parafilm, og vend dem for at blande.
Marker yderligere fem reagensglas som "Ukendt 1-5." Tilsæt de samme mængder af din ukendte eller testopløsning til hver, som du brugte med 1 molær opløsning til standarderne. Med andre ord, ukendt 1 vil indeholde 0,8 ml testopløsning og 7,2 ml vand, ukendt 2 vil indeholde 1,6 ml testopløsning og 6,4 milliliter vand osv frem.
Sæt hætten på hver af de ukendte med parafilm, og vend omhyggeligt for at blande.
Tænd spektrofotometeret, og lad det varme op. Den nødvendige tid afhænger af modellen og producenten.
Indstil bølgelængden på spektrofotometeret. Bølgelængden afhænger af typen af kemikalie i dit eksperiment. For øjeblikket antager du 500 nm, selvom du skal huske at du bliver nødt til at ændre dette til forskellige eksperimenter.
Kalibrer dit spektrofotometer. Kalibreringsproceduren varierer afhængigt af den enhed, du bruger. For Spectronic 20, en almindelig model i undervisningslaboratorier, skal du først justere maskinen, så den læser "0 procent T" når der ikke er ilagt nogen kuvette, skal du justere den, så den læser "100% T", når en tom kuvette, der kun indeholder deioniseret vand, er indlæst. Disse procedurer kan variere afhængigt af den type maskine, du bruger, så se producentens instruktioner for detaljer.
Når maskinen er kalibreret, skal du tage standard 1 reagensglas og hælde indholdet i en ren kuvette, indtil de når påfyldningslinjen. Tør kuvetten af med en kimwipe for at fjerne fingeraftryk eller andet snavs. Indsæt kuvetten i spektrofotometeret og optag aflæsningen "% T".
Gentag denne procedure for alle 10 prøver. VÆR SIKKER ved at rengøre kuvetten mellem prøverne for at sikre, at dine resultater er så nøjagtige som muligt.
Tag resultaterne for dine standarder, og indtast dem i et regneark / grafprogram som Excel eller OpenOffice.
Brug regnearksprogrammet til at dele 100 procent af hver af "% T" -værdierne for standarderne, og tag derefter loggen over resultatet. Denne beregning giver dig absorbansen. Hvis du indtaster formlen, foretager dit regnearksprogram beregningen for dig.
Eksempel: Hvis% T er 50,6, vil den formel, du indtaster i regnearksprogrammet, være som følger:
log (100 / 50,6)
Regnearkprogrammet vil regne.
Gør det samme for alle fem ukendte / eksperimentelle værdier.
Graf absorbansværdier for alle fem standarder med koncentration på x-aksen og absorbans på y-aksen. Brug en regnearksprogram til at tilpasse en lineær ligning til denne graf. Ligningen har form y = mx + b. De fleste regnearkprogrammer har en lineær regressionsfunktion. Se brugervejledningen til dit regnearksprogram for detaljer om, hvordan du bruger den lineære regressionsfunktion.
Tag ligningen for den bedst egnede linje fra dit regnearkprogram, og løs den for y ved at trække b fra begge sider og dividere begge sider med m. Resultatet ser ud som følger:
(y - b) / m = x
hvor b og m er værdier, der findes i dit regnearkprogram.
Tjek dine absorbansværdier for de ukendte, og vælg tre, der falder inden for samme område som standarderne. Brug disse tre absorbansværdier til dine resterende beregninger. Hvis alle fem falder inden for samme rækkevidde som standarderne, kan du bruge alle fem i stedet, men du skal bruge mindst tre.
Sæt hver af de tre absorbansværdier i din ligning i stedet for y. Husk, at din ligning var i følgende form:
(y - b) / m = x
Så du vil tilslutte absorbansværdien for hver ukendt i ligningen i stedet for y og derefter beregne x. Du kan bruge regnearkprogrammet til at udføre denne beregning for dig og gøre det hurtigere. Du har nu beregnet koncentrationen af kemikaliet af interesse i tre af dine fortyndede ukendte. Den oprindelige opløsning blev fortyndet for at forberede disse ukendte, så du skal nu arbejde baglæns og beregne koncentrationen af den originale opløsning baseret på fortyndingsfaktoren.
Hver ukendt prøve, du indsatte i spektrofotometeret, blev fortyndet med en anden mængde. Derfor skal du nu dele den koncentration, du har beregnet ud fra absorbansen for hver ukendt måling, med følgende:
Ukendt 1: Opdel med 0,1 Ukendt 2: Opdel med 0,2 Ukendt 3: Opdel med 0,3 Ukendt 4: Opdel med 0,4 Ukendt 5: Opdel med 0,5
Husk dog, at disse tal er baseret på den antagelse, at du bruger fortyndingerne beskrevet ovenfor. Husk at ændre disse værdier, hvis du fortyndede dine prøver med en anden mængde.
Tilføj dine resultater sammen, og divider dem med antallet af resultater. Dette giver dig et gennemsnit. Rapporter dette nummer som dit fund for koncentrationen af den originale opløsning.
Ting, du har brug for
- Blyant
- Papir
- Lommeregner
- Handsker
- Beskyttelsesbriller
- Langærmet frakke
- Spektrofotometer
- Glaskuvetter
- Parafilm
- Kimwipes
- Deioniseret vand
- Løsning, du vil teste (af ukendt koncentration)
- 1 molær standardopløsning af det kemikalie, der findes i din testopløsning
- Gradueret pipette og pære
- Reagensglas & reagensglasholder
- Bægerglas
Tips
Denne procedure lyder måske kompliceret, men den er faktisk ret ligetil, når du først er startet. Prøv at se de to videoer under afsnittet Ressourcer for at gøre dig bekendt med proceduren.