Chemici používají k oddělení směsí sloučenin vysoce účinnou kapalinovou chromatografii nebo HPLC. Obecně metoda spočívá v vstřikování vzorku do kolony, kde se smísí s jedním nebo více rozpouštědly. Různé sloučeniny se adsorbují nebo „lepí“ na sloupec v různé míře; a jak rozpouštědlo tlačí sloučeniny přes kolonu, jedna ze složek směsi opustí kolonu jako první. Přístroj detekuje sloučeniny při výstupu z kolony a vytváří chromatogram, který se skládá z grafu s retenčním časem na ose x a intenzitou signálu z detektoru na ose y. Když sloučeniny opouštějí kolonu, vytvářejí „píky“ na chromatogramu. Obecně platí, že čím dále od sebe a čím užší vrcholy na chromatogramu, tím vyšší rozlišení. Vědci považují rozlišení 1,0 nebo vyšší za dostatečné oddělení.
Změřte šířky dvou sousedních píků na chromatogramu tak, že si všimnete, kde jsou hodnoty osy x na základně každého píku. Osa x představuje retenční čas, obvykle měřený v sekundách. Pokud tedy vrchol začíná v 15,1 sekundách a končí v 18,5 sekundách, jeho šířka je (18,5 - 15,1) = 3,4 sekundy.
Určete retenční časy zaznamenáním času, tj. Umístění na ose x, které odpovídá umístění maxim maxim píků. Tato hodnota bude obvykle asi v polovině mezi dvěma hodnotami použitými k výpočtu šířky v kroku 1. Příklad uvedený v kroku 1 by například vykazoval maximum přibližně 16,8 sekundy.
Vypočítejte rozlišení R mezi dvěma vrcholy podle:
R = \ frac {RT_1-RT_2} {0,5 (W_1 + W_2)}
kde RT1 a RT2 představují retenční časy píků 1 a 2 a W1 a w2 představují šířky vrcholů pořízených na jejich základnách. Pokračováním příkladu z kroků 2 a 3 jeden vrchol vykazuje retenční čas 16,8 sekundy a šířku 3,4 sekundy. Pokud by druhý vrchol vykazoval retenční čas 21,4 sekundy se šířkou 3,6 sekundy, pak by rozlišení bylo:
R = \ frac {21,4-16,8} {0,5 (3,4 + 3,6)} = 1,3
Věci, které budete potřebovat
- HPLC chromatogram
- Kalkulačka