Podle webu BioWeb University of Wisconsin je primer PCR krátký syntetický oligonukleotid (obvykle mezi 18 až 25 bází) používané k amplifikaci specifických oblastí DNA v technice molekulární biologie známé jako polymerázová řetězová reakce (PCR). Je zapotřebí přímý i reverzní primer, navržený tak, aby reverzně doplňoval řetězec DNA, aby lemoval a navázal se na požadovanou oblast DNA. Pokud chtějí vědci provést výzkum na konkrétním genu nebo oblasti DNA, musí nejprve provést PCR, aby získali dostatek cílové oblasti pro práci. Může být nutné navrhnout sekvence primerů pro oblast zájmu, pokud již nejsou k dispozici prostřednictvím dříve publikovaného výzkumu nebo komerčních prostředků.
Získejte nukleotidovou sekvenci sledované oblasti genu nebo DNA a rozhodněte se, jak dlouho chcete fragment amplifikovat. Přímý a reverzní primer je navržen tak, aby se vázal na začátku a na konci požadovaného fragmentu. Obvykle běžné metody PCR používají primery, které lemují oblast o délce mezi 100 až 1 000 párů bází, zatímco metody PCR v reálném čase používají fragmenty dlouhé asi 50 až 200 párů bází.
Rozhodněte se, kde v pořadí chcete, aby primery ležely. Můžete například chtít umístění poblíž 5 'nebo 3' konce sekvence nebo uprostřed. Pokud je to požadováno, určete umístění primerů, které se rozprostírají po intronu.
Navrhněte základní nátěr o délce 18 až 24 bází. Vincent R. Prezioso, Ph. D., od Brinkmann Instruments Inc., naznačuje, že tato délka je dostatečně dlouhá, aby byla extrémně specifická pro požadovanou oblast DNA, ale dostatečně krátká, aby se snadno navázala (nasedla). Teplota tání primeru (Tm) by měla být mezi 55 až 80 stupni Celsia, dostatečně nízká, aby umožnila úplné roztavení při teplotě 90 ° C nebo vyšší, ale dostatečně vysoká, aby umožnila žíhání. Obsah GC (procento Gs a Cs v sekvenci) by měl být mezi 40 a 60 procenty. 3 'konec sekvence primeru by měl končit C nebo G (nazývaným GC svorka), aby se podpořilo navázání, protože G a C nukleotidy mají silnější vazby, vyhněte se však tomu, abyste měli v posledních pěti bázích sekvence tři nebo více Gs nebo Cs.
Vyvarujte se běhů čtyř nebo více jedné báze (jako ACCCC ...) nebo čtyř nebo více opakování di-nukleotidů (jako ATATATAT ...), protože by to mohlo způsobit chybné formulace. Navrhněte primery bez homologie mezi primery (více než tři báze, které se v jedné komplementují samotný primer) nebo homologie mezi primery (kde se přední a reverzní primer doplňují sekvence). To může způsobit samo-dimery nebo primer-dimery, kde se primery vážou na sebe místo vazby na požadovanou sekvenci DNA.
Využijte online zdroje a webové stránky, které pomáhají při návrhu primeru, nebo pomáhají kontrolovat sekvence primerů pro vlastní komplementaritu nebo potenciál vytvářet sekundární struktury jako vlásenky. Některé webové stránky s návrhem primerů zahrnují Primer3 Massachusetts Institute of Technology, Primer-Blast od National Center for Biotechnology Information a OligoAnalyzer od Integrated DNA Technologies.