Rekombinantní DNA (deoxyribonukleová kyselina) je syntetický typ nukleové kyseliny vytvořený spojením DNA sekvence dohromady, které by za normálních okolností a prostředí přirozeně neexistovaly podmínky.
Proces výroby rekombinantní DNA se obvykle provádí pomocí rekombinantního plazmidu. Konkrétně je vyroben pokročilým technologickým postupem DNA v biologii a genetice známým jako genové klonování. Rekombinantní DNA je vložena do buňky, která pak produkuje zcela nový protein, a slouží k syntéze léků, protilátek nebo specifických proteinů pouze pro výzkum.
Úvod do technologie rekombinantní DNA
DNA z dárcovského organismu nebo biologického zdroje se nejprve extrahuje z buněk a poté se podrobí procesu štěpení známému jako enzymatické omezení. To generuje fragmenty DNA, které obsahují požadovaný gen nebo geny. Tyto fragmenty pak mohou být „klonovány“ (tj. Vloženy) nebo přilepeny na fragmenty z přijímajícího organismu.
Dále se vloží do větších molekul DNA („rekombinantní plazmid“), které se umístí do bakterie a nechají se množit. Rekombinantní DNA je poté získána a ověřena.
Přečtěte si více o výhodách a nevýhodách technologie rekombinantní DNA.
Izolace DNA
DNA musí být nejprve extrahována a purifikována z jiných buněčných molekul, jako jsou ribonukleové kyseliny (RNA), proteiny a struktury, jako jsou buněčné membrány. Pro účely klonování se DNA získává z jádra a je známá jako „genomová DNA“. Jedna běžná metoda pro DNA extrakce probíhá ultracentrifugací buněčných složek v gradientu hustoty tvořeném ethidiumbromidem v cesiu chlorid.
Alternativně lze k izolaci DNA použít také řadu alkalických promytí a promytí solným pufrem. Jakmile je toto vysráženo a očištěno od všech ostatních nežádoucích kontaminantů, DNA může být rozřezána na fragmenty.
Trávení DNA restrikčním enzymem
Restrikční enzymy jsou enzymy, které štěpí velmi specifické sekvence DNA; používají se k vytvoření jedinečných fragmentů DNA. Tento proces zajišťuje, že nebudou generovány a stanou se žádné nepřesné, nesprávné nebo nežádoucí sekvence náhodně začleněn do konečné rekombinantní DNA, což může vést jak k experimentálnímu selhání, tak k buněčná smrt.
Ke generování požadovaných fragmentů DNA se ke štěpení nebo štěpení DNA používá konkrétní jeden (nebo kombinace) enzymu (enzymů). Fragmenty se poté čistí gelovou elektroforézou, která je odděluje od nežádoucí DNA. Metoda technologie Cruder DNA jednoduše zahrnuje mechanické stříhání, které roztrhá delší segmenty DNA na menší, které lze použít ke klonování.
DNA ligace
Ligace je proces slepování nebo spojování fragmentů DNA dárce a příjemce (nebo vektoru) za vzniku molekuly rekombinantní plazmidové DNA. V ideálním případě by restrikční enzymy zvolené k vytvoření fragmentů byly velmi pečlivě promyšleny a navrženy tak, aby umožňovaly skládání těchto kousků jako skládačky.
K tomu jsou výhodné restrikční enzymy, které produkují kompatibilní „lepivé konce“, takže se všechny kompatibilní fragmenty přirozeně spojí navzájem. Jinak lze enzym DNA ligázy použít ke spojení segmentů DNA s fosfodiesterovými vazbami.
Rekombinantní replikace DNA
Proces transformace nebo tepelného šoku se používá k vložení molekuly rekombinantní DNA do hostitelské bakteriální buňky, která pak může generovat mnoho kopií syntetické DNA. Tyto bakterie se pěstují na agarových plotnách, kultivují se ve speciálních bakteriálních bujónech a poté lyžují, aby se uvolnila rekombinantní DNA. Nakonec lze DNA ověřit sekvenováním DNA, funkčními experimenty a štěpením restrikčními enzymy.
Používá se pro rekombinantní DNA
Technologie rekombinantní DNA se používá od všeho, od akademických laboratorních experimentů po výrobu farmaceutických léků. Je také důležitou součástí sekvenování DNA a identifikace genů.
Můžete si přečíst další blízké použití Technologie DNA zde.
Přečtěte si více o rozdílech mezi rekombinantní DNA a genetickým inženýrstvím.