Spektrofotometrie je neocenitelným nástrojem v chemii a biologii. Základní myšlenka je jednoduchá: různé látky absorbují světlo / elektromagnetické záření lépe na některých vlnových délkách než na jiných. Proto jsou některé materiály průhledné, zatímco jiné jsou například barevné. Když svítíte roztokem o dané vlnové délce, čím vyšší je jeho koncentrace, tím více světla absorbuje. Chcete-li vypočítat koncentraci, musíte porovnat své hodnoty s hodnotami standardů známé koncentrace. Níže uvedený postup je poměrně obecný postup psaný s ohledem na učebnu chemie, ale lze jej upravit i pro jiná nastavení.
Při práci v laboratoři si jako vždy noste ochranné brýle, rukavice a kabát s dlouhým rukávem, abyste si zajistili vlastní bezpečnost.
Stiskněte gumovou baňku, abyste ji vyprázdnili ze vzduchu, poté ji umístěte na špičku pipety a nechejte baňku uvolnit, aby nasála vodu do pipety. Poté vyjměte baňku a prstem uzavřete horní část pipety; toto utěsní pipetu tak, aby roztok uvnitř nevytékal, dokud nebude odstraněn váš prst. Mírně zvedněte okraj prstu, aby z pipety vytékal malý roztok, dokud nedosáhnete požadovaného objemu. Cvičte s trochou vody a kádinky, abyste získali představu o tom, jak funguje odstupňovaná pipeta. Odkaz v části Zdroje obsahuje filmový klip, který vám ukáže, jak používat pipetu v případě, že jste s ní nikdy předtím nepracovali.
Označte 5 zkumavek standardy 1-5. Můžete je označit pomocí maskovací pásky a pera nebo pomocí značky pro suché mazání.
Vyberte pět koncentrací pro vaše standardy. Chcete, aby byly standardní koncentrace od sebe odděleny přibližně ve stejném intervalu - např. 0,1 molární, 0,2 molární, 0,3 molární atd. - a přibližně ve stejném rozsahu, v jakém očekáváte, že vaše neznámá bude. Prozatím použijte následujících pět koncentrací, ale nezapomeňte, že je budete muset při provádění vlastního experimentu upravit:
Standard 1: 0,1 molární Standard 2: 0,2 molární Standardní 3: 0,3 molární Standardní 4: 0,4 molární Standardní 5: 0,5 molární
Dále vezměte 1 molární standardní roztok a přidejte následující množství do zkumavek 1-5. Nezapomeňte, že tato množství se počítají pomocí výše uvedených koncentrací, takže při provádění vlastního experimentu je možná budete muset podle potřeby upravit.
Standardně 1: 0,8 mililitru Standardně 2: 1,6 mililitru Standardně 3: 2,4 mililitru Standardně 4: 3,2 mililitru Standardně 5: 4 mililitry
Opláchněte pipetu se stupnicí a poté přeneste následující množství deionizované vody:
Standard 1: 7,2 mililitrů Standard 2: 6,4 mililitrů Standard 3: 5,6 mililitrů Standard 4: 4,8 mililitrů Standard 5: 4,0 mililitrů
Myšlenkou je v zásadě zvýšit množství roztoku v každé zkumavce až na 8 mililitrů.
Uzavřete každou ze standardních zkumavek parafilmem a převraťte je, aby se promíchaly.
Označte dalších pět zkumavek jako „Neznámé 1–5“. Přidejte do každého stejného množství neznámého nebo testovaného roztoku, jaké jste použili s 1 molárním roztokem pro standardy. Jinými slovy, neznámá 1 bude obsahovat 0,8 mililitru testovacího roztoku a 7,2 mililitrů roztoku voda, neznámá 2 bude obsahovat 1,6 mililitru zkoušeného roztoku a 6,4 mililitrů vody atd dále.
Zakryjte každou z neznámých parafilmem a opatrně ji promíchejte.
Zapněte spektrofotometr a nechte jej zahřát. Potřebná doba bude záviset na modelu a výrobci.
Na spektrofotometru nastavte vlnovou délku. Vlnová délka bude záviset na typu chemikálie ve vašem experimentu. Prozatím předpokládejme 500 nm, i když si pamatujte, že to budete muset u různých experimentů změnit.
Kalibrujte svůj spektrofotometr. Postup kalibrace se bude lišit v závislosti na zařízení, které používáte. U modelu Spectronic 20, který je běžným modelem výukových laboratoří, nejprve nastavíte stroj tak, aby zněl „0 procent T“ když není vložena žádná kyveta, upravte ji tak, aby zněla „100% T“, když je prázdná kyveta obsahující pouze deionizovanou vodu načten. Tyto postupy se mohou lišit v závislosti na typu zařízení, které používáte, proto si přečtěte pokyny výrobce.
Po kalibraci zařízení vezměte standardní 1 zkumavku a nalijte obsah do čisté kyvety, dokud nedosáhne plnicí linky. Kyvetu otřete kimwipe, abyste odstranili otisky prstů nebo jiné nečistoty. Vložte kyvetu do spektrofotometru a zaznamenejte hodnotu „% T“.
Tento postup opakujte pro všech 10 vzorků. UJISTĚTE, že kyvetu mezi vzorky čistíte, abyste se ujistili, že vaše výsledky jsou co nejpřesnější.
Vezměte výsledky pro své standardy a zadejte je do tabulkového / grafického programu, jako je Excel nebo OpenOffice.
Pomocí tabulkového procesoru vydělte 100 procent každou z hodnot „% T“ pro standardy a poté proveďte protokol výsledku. Tento výpočet vám dá absorbanci. Pokud zadáte vzorec, váš tabulkový program provede výpočet za vás.
Příklad: Pokud je% T 50,6, bude vzorec, který zadáte do tabulkového procesoru, následující:
protokol (100 / 50,6)
Tabulkový program provede aritmetiku.
Totéž proveďte u všech pěti neznámých / experimentálních hodnot.
Grafy hodnot absorbance pro všech pět standardů, s koncentrací na ose x a absorbance na ose y. Pomocí tabulkového kalkulátoru přizpůsobte tomuto grafu lineární rovnici. Rovnice bude mít tvar y = mx + b. Většina tabulkových programů bude mít funkci lineární regrese. Podrobnosti o tom, jak používat funkci lineární regrese, najdete v uživatelské příručce k vašemu tabulkovému programu.
Vezměte z vašeho tabulkového programu rovnici pro nejvhodnější přímku a vyřešte ji pro y odečtením b od obou stran a dělením obou stran m. Výsledek bude vypadat takto:
(y - b) / m = x
kde b a m jsou hodnoty nalezené vaším tabulkovým programem.
Zkontrolujte hodnoty absorbance pro neznámé a vyberte tři, které spadají přibližně do stejného rozsahu jako standardy. Tyto tři hodnoty absorbance použijte pro zbývající výpočty. Pokud všech pět spadá do stejného rozsahu jako standardy, můžete místo toho použít všech pět, ale musíte použít alespoň tři.
Připojte každou ze tří hodnot absorbance do vaší rovnice namísto y. Nezapomeňte, že vaše rovnice byla v následující podobě:
(y - b) / m = x
Budete tedy chtít místo hodnoty y připojit hodnotu absorbance pro každou neznámou do rovnice a poté vypočítat x. Pomocí tabulkového procesoru můžete tento výpočet provést a zrychlit. Nyní jste vypočítali koncentraci sledované chemické látky ve třech zředěných neznámých. Původní roztok byl však na přípravu těchto neznámých zředěn, takže nyní musíte pracovat zpět a vypočítat koncentraci původního roztoku na základě faktoru ředění.
Každý neznámý vzorek, který jste vložili do spektrofotometru, byl zředěn jiným množstvím. V důsledku toho byste nyní měli rozdělit koncentraci, kterou jste vypočítali na základě absorbance pro každé neznámé měření, následujícím způsobem:
Neznámý 1: Vydělte 0,1 Neznámý 2: Vydělte 0,2 Neznámý 3: Vydělte 0,3 Neznámý 4: Vydělte 0,4 Neznámý 5: Vydělte 0,5
Nezapomeňte však, že tyto údaje vycházejí z předpokladu, že používáte výše uvedená ředění. Nezapomeňte tyto hodnoty změnit, pokud jste vzorky naředili o jiné množství.
Přidejte své výsledky dohromady a vydělte je počtem výsledků. To vám dá průměr. Uveďte toto číslo jako své zjištění koncentrace původního roztoku.
Věci, které budete potřebovat
- Tužka
- Papír
- Kalkulačka
- Rukavice
- Ochranné brýle
- Kabát s dlouhým rukávem
- Spektrofotometr
- Skleněné kyvety
- Parafilm
- Kimwipes
- Deionizovaná voda
- Řešení, které chcete otestovat (neznámé koncentrace)
- 1 molární standardní roztok chemikálie přítomné ve vašem testovacím roztoku
- Odměrná pipeta a baňka
- Zkumavky a stojan na zkumavky
- Kádinka
Tipy
Tento postup může znít komplikovaně, ale ve skutečnosti je to docela jednoduché, jakmile začnete. Zkuste se podívat na dvě videa v části Zdroje, abyste se seznámili s postupem.