Biochemici a molekulární biologové používají elektroforézu k oddělení makromolekul, jako jsou proteiny a nukleové kyseliny. To umožňuje vědcům izolovat a analyzovat jednotlivé proteiny nebo sekvence nukleových kyselin ve složité směsi. Typickým příkladem elektroforézy v laboratoři je mikrobiolog využívající polymerázovou řetězovou reakci (PCR) k oddělení fragmentů DNA produkovaných v mikrobiální komunitě. Bez ohledu na účel vyžaduje elektroforéza vždy použití pufrovacího roztoku.
TL; DR (příliš dlouhý; Nečetl)
Elektroforéza odděluje makromolekuly, jako je protein a nukleové kyseliny, podle velikosti, náboje a dalších vlastností. Pro elektroforézu, která se odděluje nábojem, používají vědci k přenosu náboje přes gel pufr. Pufr také udržuje gel na stabilním pH, minimalizuje změny, které by mohly nastat v proteinu nebo nukleové kyselině, pokud by byly vystaveny nestabilnímu pH.
Principy elektroforézy
Elektroforéza odděluje molekuly podél gradientu na základě jejich velikosti, náboje nebo jiných vlastností. Tímto gradientem může být elektrické pole nebo v případě Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) denaturant, jako je směs močoviny a formamidu. Pokud jsou proteiny negativně nabité, proteiny migrují směrem k anodě, pokud jsou kladně nabité, katoda. Vzhledem k tomu, že větší molekuly migrují pomaleji než menší molekuly, mohou vědci měřit ujetou vzdálenost a pomocí logaritmů určit velikost fragmentů.
Denaturační gradientová gelová elektroforéza
S DGGE se DNA pohybuje podél gradientu zvyšující se denaturační síly, dokud není síla dostatečná k úplné denaturaci nebo rozvinutí konkrétního fragmentu DNA. V tomto okamžiku se migrace zastaví. Vědci mohou pomocí této metody oddělit fragmenty na základě jejich individuální náchylnosti k denaturaci.
Co dělá Buffer
V případě elektroforézy, která se odděluje na základě náboje, přenášejí ionty v pufru náboj potřebný pro oddělení. Pufr, který poskytuje rezervoár slabé kyseliny a zásady, také udržuje pH v úzkém rozmezí. To je důležité, protože struktura a náboj proteinu nebo nukleové kyseliny se změní, pokud jsou vystaveny významným změnám pH, čímž zabrání správné separaci.
Typické vyrovnávací paměti
Různé pufry jsou ideální pro udržování elektroforetického gelu v různých požadovaných rozmezích pH. Typické pufry používané vědci pro tento účel zahrnují kyselinu octovou, kyselinu boritou, kyselinu fosforečnou a kyselinu citrónovou, stejně jako glycin a taurin. Obecně by hodnota pKa (disociační konstanta kyseliny) měla být blízká požadovanému pH. Pro nás je vhodnější vyrovnávací paměti, které poskytují velikost malého náboje, aby nevodily příliš mnoho proudu.