Полимеразната верижна реакция или PCR е техника, която копира един фрагмент от ДНК в много фрагменти - експоненциално много. Първата стъпка е в PCR да се нагрее ДНК, така че тя да се денатурира или разтопи на единични вериги. Структурата на ДНК е като въжена стълба, в която стъпалата са въжета с магнитни краища. Магнитите се свързват, за да образуват стъпала, наречени базови двойки, и по този начин се противопоставят на раздвояване. Всеки фрагмент от ДНК се топи на единични нишки при различни температури. Разбирането как структурата на ДНК се държи заедно от отделните части на ДНК ще даде представа защо различни ДНК фрагменти се топят при различни температури и защо са необходими толкова високи температури в първия място.
Топи се! Топи се!
Първата стъпка на PCR е да се стопи ДНК, така че двуверижната ДНК да се отдели в едноверижна ДНК. За ДНК на бозайници тази първа стъпка обикновено включва топлина от около 95 градуса по Целзий (около 200 градуса по Фаренхайт). При тази температура водородните връзки между двойките основи A-T и G-C или стъпалата в ДНК стълбата се разпадат, разкопчавайки двуверижната ДНК. Температурата обаче не е достатъчно висока, за да разчупи фосфатно-захарния гръбнак, който образува единичните нишки или стълбовете на стълбата. Пълното разделяне на единични вериги ги подготвя за втората стъпка на PCR, която се охлажда, за да позволи на къси фрагменти от ДНК, наречени праймери, да свържат единичните вериги.
Магнитни ципове
Една от причините ДНК да се нагрява до високата температура от 95 градуса по Целзий е, че колкото по-дълга е двойната верига на ДНК, толкова повече иска да остане заедно. Дължината на ДНК е един фактор, който влияе върху точката на топене, избрана за PCR върху тази част от ДНК. Двойките A-T и G-C основи в двуверижната ДНК връзка помежду си, за да задържат двойно верижната структура заедно. Колкото повече последователни базови двойки между две единични нишки са свързани, толкова повече техните съседи също искат да се свържат и толкова по-силно става привличането между двете нишки. Той е като цип, направен от малки магнити. Докато затваряте ципа, магнитите естествено ще искат да закопчат ципа и да останат с цип.
По-силните магнити се придържат по-плътно
Друг фактор, който влияе коя температура на топене да изберете за вашия ДНК фрагмент, който представлява интерес, е количеството G-C базови двойки, присъстващи във този фрагмент. Всяка основна двойка е като два мини-магнита, които привличат. Двойка, направена от G и C, е много по-силно привлечена от двойка A и T. По този начин парче ДНК, което има повече G-C двойки, отколкото друг фрагмент, ще изисква по-висока температура, преди да се стопи в единични вериги. ДНК поглъща естествено ултравиолетовата светлина - с дължина на вълната 260 нанометра, за да бъдем точни - и едноверижната ДНК поглъща повече светлина, отколкото двойно верижната ДНК. Така че измерването на количеството погълната светлина е начин за измерване на това колко двойно верижната ви ДНК се е стопила в единични вериги. Ефектът на "магнитния цип" на G-C и A-T базовите двойки е това, което причинява графика на светлинната абсорбция на двуверижна ДНК, начертана срещу повишаване на температурата, да бъде сигмоидна, с форма на S, а не a права. Кривата на S представлява съпротивлението за екипна работа, което базовите двойки оказват срещу топлината, защото не искат да се разделят.
Половината
Температурата, при която една дължина на ДНК се топи на единични нишки, се нарича нейната температура на топене, която се обозначава със съкращението „Tm“. Това показва температурата, при която половината ДНК в разтвор се е стопила на единични вериги, а другата половина е все още в двойна верига форма. Температурата на топене е различна за всеки фрагмент от ДНК. ДНК на бозайници има съдържание на G-C от 40%, което означава, че останалите 60% от базовите двойки са As и Ts. Съдържанието му на 40% G-C кара ДНК на бозайниците да се топи при 87 градуса по Целзий (около 189 по Фаренхайт). Ето защо първата стъпка на PCR върху ДНК на бозайници е да се нагрее до 94 градуса по Целзий (201 по Фаренхайт). Само седем градуса по-горещо от температурата на топене и всички двойни нишки напълно ще се стопят до единични нишки.