Какво представлява замразяването на фрактурите и защо е полезно в клетъчната биология?

Клетъчните мембрани се състоят от фосфолипиди и прикрепени или вградени протеини. Мембранните протеини играят жизненоважна роля в метаболизма и живота на клетката. Не можете да използвате обикновена микроскопия, за да визуализирате или характеризирате адхезионни протеини, транспортни протеини и протеинови канали в клетъчната мембрана. Използвайки електронна микроскопия и техника, наречена "замразяване на фрактура", която разделя замразените клетъчни мембрани, позволява визуализация на мембранната структура и организирането на протеини в морето на фосфолипиди. Комбинирането на други методи с замразяване на фрактури не само ни помага да разберем структурата на различните клетъчни мембрани и мембранни протеини, но дава възможност за визуализация и подробен анализ на функцията на специфични протеини, бактерии и вируси.

Използвайки течен азот, биологичните тъканни проби или клетки бързо се замразяват, за да обездвижат клетъчните съставки. Клетъчните мембрани са съставени от два слоя фосфолипиди, наречени двуслой, където хидрофобните или ненавиждащи водата липидни опашки сочат към вътрешността на мембраната и хидрофилните или водолюбиви краища на липидната молекула сочат навън и към вътрешността на клетка. Замразената проба се напуква или счупва с микротом, който е инструмент, подобен на нож за рязане на тънки резени тъкан. Това кара клетъчната мембрана да се раздели точно между двата слоя, тъй като привличането между хидрофобните липидни опашки представлява най-слабото място. След фрактурирането пробата се подлага на вакуумна процедура, наречена "замразяване на ецване". Повърхността на фрактурата пробата се засенчва с въглерод и платинова пара, за да се получи стабилна реплика, която следва контурите на фрактурата самолет. Киселината се използва за смилане на органичен материал, прилепнал към репликата, оставяйки тънка платинена обвивка на счупената повърхност на мембраната. След това тази обвивка се анализира чрез електронна микроскопия.

Лиофилното ецване е вакуумно сушене на нефиксирана, замразена и замразена биологична проба. Процедурата на вакуумно сушене е подобна на сушенето чрез замразяване на плодове и зеленчуци, които се пакетират и продават в хранителни магазини. Без замръзване гравиране много детайли от клетъчната структура са затъмнени от ледени кристали. Етапът на дълбоко или замразяване гравиране подобрява и разширява оригиналния метод на замразяване на замразяване, позволявайки наблюдението на клетъчните мембрани по време на различни дейности. Позволява анализ на не само мембранната структура, но и на вътреклетъчните компоненти и предоставя подробна структурна информация за бактерии, вируси и големи клетъчни протеини комплекси.

Електронната микроскопия може да разкрие и увеличи повече от милион пъти най-малките организми или структури, като бактерии, вируси, вътреклетъчни компоненти и дори протеини. Визуализацията се създава чрез бомбардиране на ултратънка проба с лъч електрони. Двата метода за електронна микроскопия са сканираща електронна микроскопия или SEM и трансмисионна електронна микроскопия или TEM. Пробите от замръзнали фрактури се анализират рутинно с ТЕМ. TEM има по-добра разделителна способност от SEM и предлага структурна информация до 3 нанометра реплики.

Разработването и използването на електронна микроскопия със замразени фрактури показа, че клетъчните плазмени мембрани са изградени от липидни бислои и изясни как са организирани протеините в клетъчните мембрани. Замразяващата фрактура дава уникален поглед върху вътрешността на клетъчните мембрани, тъй като тя се разделя и разделя мембранните фосфолипиди на два противоположни и допълващи се листа или лица. През повече от 50 години от въвеждането на първата машина за замразяване на замразяване, направата на платинена реплика все още е единственият начин за получаване на структурна информация за клетъчната мембрана. Техниката показва дали специфични протеини плават или са закотвени в клетъчната мембрана и дали и как някои протеини се агрегират. По-нов метод - използване на антитела, насочени към специфични протеини - се комбинира със замразяване на фрактури за идентифициране на протеини и тяхната функция в клетъчната мембрана.