Електрофорезата с натриев додецил сулфат-полиакриламиден гел (SDS-PAGE) е биохимичен метод за идентифициране на протеини в разтвор. Както е илюстрирано от Mathews et al в "Биохимия", протеиновите проби първо се зареждат в "ямки" или отвори в единия край на полиакриламидния гел блок. След това върху гела се прилага електрическо поле. SDS, добавен към заредените проби, отрича естествения заряд на протеините. Поради тази причина само молекулното тегло на протеините определя скоростта на миграция на протеините, докато те се движат през гела към положително заредения полюс, отбелязва Bitesize Bio. Следователно множество протеини в една и съща проба ще се отделят един от друг и ще мигрират в различни позиции.
Ориентирайте геловата снимка. "Top" е местоположението на кладенците, където първоначално са добавени пробите. "Отдолу" е мястото, където пробите мигрират към и най-често съдържат багрилния фронт, който показва мигриращия фронт на пробите. Отляво или отдясно трябва да съдържат "маркер", използван като предсказуемо ръководство за молекулно тегло.
Маркирайте пробите за всяка лента. В горната част пробите, добавени в кладенците, ще мигрират вертикално в "платна". Следователно всички ленти, видими във вертикална колона, идват от една проба, заредена точно над нея. Използвайте линийката и писалката, за да поставите граници на лентите, ако е трудно да визуализирате колони.
Маркирайте молекулните размери на лентите в маркера. Наличните в търговската мрежа маркери идват със снимка на модела на лентата, който се очаква заедно с молекулните тегла на всяка лента. Лентите са тъмните хоризонални "ленти", които всъщност са оцветени протеини, вградени в гела.
Начертайте леки хоризонтални линии, простиращи се от всяка лента на маркера до противоположния ръб на гела. Внимавайте да направите тези линии успоредни на кладенците и на предната част на багрилото. Тези редове показват къде протеините с молекулно тегло, посочени от всяка от маркерните ленти, ще бъдат разположени във всяка лента. Например лента в лента 4, която се намира точно под линията, удължена от 25-килодалтона маркерната ивица предполага, че лентата 4 е почти, но не съвсем 25 килодалта в молекула тегло.
Обозначете всяка лента във всяка лента с нейното приблизително молекулно тегло. Използвайте маркерите като ориентир и изчислете стойности между размерите на маркерите.
Под снимката на гела направете списък с „протеини“ за всяка лента. Започнете, като посочите какво е известно за всяка проба, като нейния произход или условия. След това избройте приблизителното молекулно тегло на всяка лента в лентата. Линии с една лента показват, че пробата съдържа само един протеин. Линии с множество ленти показват наличието на множество протеини. Обхватите, които се изпълняват с миграционния фронт, са по-малки от предложените от най-близкия маркер и вероятно не могат да бъдат предвидени, освен ако маркерът показва "по-малък от".
В списъка с протеини обърнете внимание на странностите. "Размазан" външен вид може да означава, че присъстват твърде много протеини или че вискозитетът на пробата е повлиял на нейната миграция Ако изглежда, че лентите надхвърлят ръба на лентата или са доста големи в сравнение с други ленти, тогава концентрацията на този протеин вероятно е твърде висока и трябва да се разрежда в бъдеще електрофореза. Сивкав оттенък в цялата лента, по-тъмен от фоновия цвят на гела, показва неразличими протеинови фрагменти.
Определете идентичността на протеините във всяка лента. Въпреки че това се прави, като се използва само молекулно тегло, източникът на всяка лента вероятно също ще посочи улики. Помислете, че при някои условия протеините могат да поддържат димер или тримерна асоциация върху гел. Следователно, един протеин може да се появи на гел като три отделни ленти. Дори ако протеините не могат да бъдат идентифицирани, относителната тъмнина на лентите може да означава концентрациите на протеините в разтвор. Всички любопитни и неизвестни протеини могат да бъдат изолирани директно от оригиналния гел и изпратени за идентификация.
Неща, от които ще се нуждаете
- Снимка на SDS-PAGE гел, оцветена
- Ключ за използвания маркер за молекулно тегло
- Владетел
- Химилка