يتم ترميز المخطط الجيني للخلية داخل مادتها الجينية أو الحمض النووي. نظرًا لأن الحمض النووي لا يترك أبدًا نواة الخلية ، من أجل أن تصل هذه المعلومات إلى السيتوبلازم في مكان آخر. توجد البروتينات والمكونات الكيميائية الحيوية ، فمن الضروري أولاً نسخ الحمض النووي إلى مرسال RNA (mRNA أو poly (أ) RNA). ثم يُترجم هذا الرنا المرسال إلى بروتينات تقوم بالعديد من وظائف الخلية. لاكتشاف أو تحديد كمية mRNAs النادرة جدًا ، أو إجراء تحقيقات للمصفوفات الدقيقة أو إنشاء مكتبات من جزيئات الحمض النووي التكميلية ، يجب عزل mRNA. ومع ذلك ، فإن إجمالي استخراج الحمض النووي الريبي (أي كل الحمض النووي الريبي في الخلية) وعزل الحمض النووي الريبي اللاحق ليست عمليات حصرية ؛ يجب إجراء السابق من أجل استخراج الرنا المرسال.
تجانس تريزول: يشمل إجمالي الحمض النووي الريبي جميع الرنا المرسال ، ونقل الحمض النووي الريبي ، والحمض النووي الريبوزي ، وغير ذلك من عمليات الترميز الحمض النووي الريبي. لفصل هذه عن المكونات الخلوية الأخرى ، تنفجر الخلية أولاً لتحريرها محتويات. يتم ذلك عن طريق إعادة تعليق الخلايا المحببة بالطرد المركزي (الدوران بسرعات عالية) في كاشف TRIzol (تقنيات الحياة). إصدارات أخرى من TRIzol (مثل Ambion's TRI Reagent) تعمل بشكل مشابه.
عزل الحمض النووي الريبي الكلي: تستخدم سلسلة من الطرد المركزي لفصل المكونات المختلفة (البروتينات ، الحمض النووي ، الحمض النووي الريبي) للخلية إلى طبقات ، أو مراحل ، داخل التعليق. تتكون المرحلة العلوية ذات اللون الأصفر من الدهون ويمكن التخلص منها. المرحلة المرغوبة ملونة باللون الأحمر وتحتوي على إجمالي الحمض النووي الريبي ويتم الاحتفاظ بها. بعد إجراء استخلاص الفينول والكلوروفورم وسلسلة من غسل الكحول باستخدام الأيزوبروبانول والإيثانول ، يمكن تكوير الحمض النووي الريبي لعزل الرنا المرسال. أضف مثبطات RNase لمنع هذا الإنزيم من تدهور إجمالي الحمض النووي الريبي.
استخراج mRNA: من الشائع استخدام مجموعة لعزل mRNAs ، لأن بروتوكولات المختبر محلية الصنع لا تولد كميات كبيرة من mRNAs عالية النقاء. تشمل المجموعات التجارية FastTrack 2.0 من Invitrogen أو Ambion’s Poly (A) Pure mRNA Isolation عدة. هذه الخطوات الأساسية شائعة في مثل هذه المجموعات:
د) طرد هذه العينة واستعادة المادة الطافية ، التي يتم غسلها عدة مرات في سلسلة من المحاليل المنظمة الملزمة والمنخفضة الملح المتوفرة في المجموعات.
مراجع
- "بروتوكولات مكتبة cDNA؟" ؛ إيان ج. كويل وكارولين أ. أوستين؛ 1997
- "النسخ المختبري وبروتوكولات الترجمة؟" ؛ مارتن ج. تيمز. 1995
نصائح
- حافظ على برودة جميع الكواشف والخلايا والحمض النووي الريبي بالغمر في الجليد. هذا يمنع الحمض النووي الريبي من التحلل من قبل أي إنزيمات أخرى يتم إطلاقها أثناء عملية التجانس.
تحذيرات
- الكواشف مثل TRIzol سامة ويجب ألا تتلامس مع الجلد أو الأغشية المخاطية. احرص دائمًا على مراعاة بروتوكولات المعمل الآمنة عند التعامل مع هذا الكاشف.
عن المؤلف
بالمر أويونغ حاصل على درجة الماجستير في إدارة الأعمال الدولية من جامعة كاليفورنيا في سان دييغو وأ ليسانس الآداب في علم الاجتماع من جامعة كاليفورنيا في سانتا باربرا وهو مدرب جزيئي أحيائي. كان كاتبًا مستقلاً منذ عام 2006. بالإضافة إلى الكتابة ، فهو تاجر فوركس متفرغ ومسوق عبر الإنترنت.
اعتمادات الصورة
جوبيتيريماجيس / فوتوس.كوم / جيتي إيماجيس