Полімеразна ланцюгова реакція, або ПЛР, - це техніка, яка копіює один фрагмент ДНК на безліч фрагментів - експоненціально багато. Першим кроком у ПЛР є нагрівання ДНК так, щоб вона денатурувалась або розплавилася в одиничні ланцюги. Структура ДНК схожа на мотузкову драбину, в якій ступенями є мотузки з магнітними кінцями. Магніти з'єднуються, утворюючи простінки, які називаються базовими парами, і таким чином протистоять розриванню. Кожен фрагмент ДНК плавиться в окремі ланцюги при різних температурах. Розуміння того, як структуру ДНК утримують окремі частини ДНК, дасть змогу зрозуміти, чому різні фрагменти ДНК плавляться при різних температурах і чому спочатку потрібні такі високі температури місце.
Тане! Тане!
Першим кроком ПЛР є розплавлення ДНК таким чином, щоб дволанцюгова ДНК поділилася на одноцепочечну ДНК. Для ДНК ссавців цей перший етап зазвичай включає тепло приблизно 95 градусів за Цельсієм (близько 200 за Фаренгейтом). При цій температурі водневі зв’язки між парами основ A-T і G-C, або проміжками в ДНК-драбині, розпадаються, розпаковуючи дволанцюгову ДНК. Однак температура недостатньо гаряча, щоб розірвати фосфатно-цукровий кістяк, що утворює окремі нитки, або полюси сходів. Повне розділення одиничних ланцюгів готує їх до другого етапу ПЛР, який охолоджує, щоб короткі фрагменти ДНК, звані праймерами, зв’язували одиничні ланцюги.
Магнітні блискавки
Однією з причин нагрівання ДНК до високої температури 95 градусів Цельсія є те, що чим довше подвійна ланцюг ДНК, тим більше вона хоче залишатися разом. Довжина ДНК є одним із факторів, який впливає на температуру плавлення, обрану для ПЛР на цій частині ДНК. Пари A-T і G-C у дволанцюжковому зв’язку ДНК зв’язані між собою, щоб утримувати дволанцюгову структуру разом. Чим більше послідовних основних пар між двома одножильними зв’язками, тим більше їх сусіди також хочуть зв’язатись, і тим сильнішим стає тяжіння між двома нитками. Це як блискавка, зроблена з маленьких магнітиків. Коли ви закриваєте блискавку, магніти природно захочуть застібнути на блискавку і залишатися на блискавці.
Більш міцні магніти тримаються щільніше
Іншим фактором, який впливає на те, яку температуру плавлення вибрати для фрагмента ДНК, що нас цікавить, є кількість пар основ G-C, присутніх у цьому фрагменті. Кожна пара основна подібна до двох міні-магнітів, які приваблюють. Пара, складена з G і C, набагато сильніше приваблює, ніж пара A і T. Таким чином, шматок ДНК, який має більше пар G-C, ніж інший фрагмент, потребуватиме більш високої температури перед плавленням в окремі ланцюги. ДНК природним чином поглинає ультрафіолетове світло - точніше на довжині хвилі 260 нанометрів - і одноцепочечна ДНК поглинає більше світла, ніж дволанцюгова ДНК. Отже, вимірювання кількості поглиненого світла - це спосіб виміряти, наскільки ваша дволанцюгова ДНК розплавилася в одиничні ланцюги. Ефект "магнітної блискавки" пар G-C та A-T - це те, що викликає графік поглинання світла дволанцюжкова ДНК, побудована проти підвищення температури, має сигмоподібну форму, має форму S, а не a пряма лінія. Крива S представляє опір колективної роботи, який пари основ справляють проти спеки, оскільки вони не хочуть розділятися.
На півдорозі
Температура, при якій довжина ДНК плавиться в окремі ланцюги, називається її температурою плавлення, що позначається абревіатурою "Tm". Це вказує на температуру, при якій половина ДНК у розчині розплавляється в одиничні ланцюги, а друга половина все ще у дволанцюжкові форму. Температура плавлення різна для кожного фрагмента ДНК. ДНК ссавців має вміст G-C 40%, тобто решта 60% пар основ становлять As і Ts. Вміст G-C у ньому становить 40%, і ДНК ссавців плавиться при 87 градусах Цельсія (близько 189 за Фаренгейтом). Ось чому першим кроком ПЛР на ДНК ссавців є нагрівання її до 94 градусів Цельсія (201 за Фаренгейтом). Лише на сім градусів тепліше температури плавлення, і всі подвійні нитки повністю розплавляться до одиночних ниток.