ДНК
Дезоксирибонуклеїнова кислота та білки. ДНК організована в одиниці, які називаються генами, кожен з яких кодує певну послідовність РНК або білка. Гени вивчаються для вивчення біологічної будови та функцій, еволюції, хвороб та багатьох інших аспектів живих систем. Для детального вивчення генів необхідно виділити та очистити ДНК із клітин, що нас цікавлять.
Вилучення ДНК
Хоча ДНК з однієї клітини можна витягти та вивчити, цього недостатньо, щоб побачити неозброєним оком. Щоб отримати кількість, достатню для спулінгу, чим більше клітин вам доведеться працювати, тим краще (багато мільйонів).
Точні протоколи значно різняться, враховуючи унікальні характеристики конкретних зразків, але загальними етапами є гомогенізація, лізис, травлення, відділення та збір. Процедуру найкраще проводити в невеликій (залежно від розміру проби) скляній або пластиковій пробірці.
Зразок, як правило, змішують або подрібнюють, щоб ретельно відокремити клітини одна від одної. Це робить клітинні інгредієнти більш доступними для реагентів, що слідують далі. Потім до гомогенату додають миючий засіб або ферменти для лізису клітинних мембран (і ядерних мембран, якщо клітини є еукаріотичними) для звільнення ДНК. У цей момент ДНК оточена білками, ліпідами, вуглеводами, усім іншим, що містилося в клітинах.
Для розщеплення білків може знадобитися подальше ферментативне травлення, щоб вони не зв’язувались з ДНК і не перешкоджали її збору. ДНК відокремлюється від решти вмісту клітини додаванням холодного, чистого, етилового або ізопропілового спирту. ДНК не розчиняється в цих спиртах, тому вона буде конденсуватися, намагаючись мінімізувати її контакт зі спиртом. Потім конденсовану ДНК збирають, як правило, центрифугуванням або намотуванням.
Спілінг ДНК
Збір ДНК методом спулінгу ефективний, коли в результаті екстракції отримують велику кількість ДНК. Це також чудовий демонстраційний метод, оскільки добре видно вражаючий клубок чистої ДНК.
Щоб розподілити ДНК, поділ на етапі необхідно проводити обережно. Якщо вона не входила до попередньо доданої суміші реагенту для лізису, перед розчином додавання спирту до розчину необхідно додати концентрований розчин солі (хлорид натрію). Холодний спирт повільно виливають збоку пробірки, утворюючи шар поверх водного розчину, уникаючи перемішування. Якщо все зробити правильно, спирт утворить свій шар поверх солоного шару. Потім відбувається спулінг.
Щоб зібрати ДНК із солоного шару, обережно покладіть скляний стрижень, хоч і спиртовий шар, поки він не торкнеться дна пробірки. Повільно обертайте стрижень між пальцями, одночасно спостерігаючи за межею між двома шарами. Якщо присутня достатня кількість ДНК, вона буде злипатися на межі розділу шарів, утворюючи молочну напівпрозору масу. Закрутіть стрижень, щоб обернути ДНК навколо нього (тобто частину, що намотується) і витягніть його з трубки. ДНК можна перенести в іншу пробірку чистого спирту для зберігання або подальшого аналізу.