Клонування ДНК: визначення, процес, приклади

Можна клонувати цілі організми, такі як вівця Доллі, але клонування ДНК відрізняється. У ньому використовуються методи молекулярної біології ідентичні копії послідовностей ДНК або окремих генів.

За допомогою методів генної інженерії ідентифікують та виділяють сегменти генетичного коду ДНК. Потім клонування ДНК копіює нуклеїнова кислота послідовності в сегментах.

Отримані однакові копії можуть бути використані для подальших досліджень або для біотехнологічних програм. Часто скопійований ген кодує білок, який може бути частиною медичного лікування. ДНК-технологія в тому числі Клонування ДНК підтримує розуміння того, як працюють гени і як генетичний код людини впливає на функціонування організму.

Клонування ДНК - це процес молекулярної біології створення однакових копій сегментів ДНК, розташованих у хромосомах, що містять генетичний код розвинених організмів.

У процесі генерується велика кількість послідовності ДНК-мішені. Метою клонування ДНК є отримання самих цільових послідовностей ДНК або отримання білків, кодованих у цільових послідовностях.

Називаються два методи, що використовуються при клонуванні ДНК плазмідний вектор і полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). В плазмідний вектор методом, нитки ДНК розрізають за допомогою ферменти рестрикції для отримання фрагментів ДНК, а отримані сегменти вставляють у клонуючі вектори, звані плазмідами, для подальшого дублювання. Плазміди розміщуються в бактеріальних клітинах, які потім продукують копії ДНК або кодовані білки.

В Метод ПЛР, сегмент ниток ДНК, що підлягає продублюванню, позначений ферментами ґрунтовки. Фермент полімерази робить копії позначеної частини ланцюга ДНК. Цей метод не використовує рестрикційні ферменти і може продукувати клоновану ДНК з невеликих зразків. Іноді два методи технології ДНК використовуються разом, щоб включити найкращі особливості кожного з них у загальну реакцію.

Вектор методу відноситься до плазміди, яка використовується для утримання цільового сегменту ДНК, який потрібно клонувати. Плазміди - це невеликі круглі нитки нехромосомна ДНК міститься в багатьох організмах, включаючи бактерії та віруси.

Бактеріальні плазміди є вектором, що використовується для вставки цільового сегмента ДНК у бактеріальні клітини для подальшого розмноження.

Вибір та виділення цільової ДНК: Перш ніж розпочати процес клонування ДНК, слід визначити послідовності ДНК, особливо початки та кінці сегментів ДНК.

Такі послідовності ДНК можна знайти, використовуючи існуючу клоновану ДНК з відомими послідовностями або вивчаючи білок, що продукується цільовою послідовністю ДНК. Як тільки послідовність буде відома, можна використовувати відповідні ферменти рестрикції.

Вирізання цільової ДНК ферментами рестрикції: Ферменти обмеження відбираються для пошуку коду ДНК на початку та в кінці цільових послідовностей.

Коли ферменти рестрикції знаходять спеціальну закодовану послідовність пар основ, яка називається сайтами рестрикції, вони приєднуються до ДНК в цьому місці і обмотуються навколо молекули ДНК, розриваючи пасмо. Вирізані сегменти ДНК, що містять цільову послідовність, тепер доступні для дублювання.

Вибір плазмідного вектора та введення цільової ДНК: Відповідна плазміда в ідеалі містить ті самі послідовності кодування ДНК, що і ланцюг ДНК, з якої була вирізана цільова ДНК. Круговий ланцюг ДНК плазміди розрізають тими самими ферментами рестрикції, що використовувались для розрізання цільової ДНК.

A ДНК-лігазний фермент використовується для сприяння зв'язуванню сегментів ДНК, а кінці цільового сегмента ДНК зв'язуються з вирізаними кінцями плазмідної ДНК. ДНК-мішень тепер є частиною кругового ланцюга плазмідної ДНК.

Введення плазміди в бактеріальну клітину: Як тільки плазміда містить послідовність ДНК, яку потрібно клонувати, фактичне клонування може відбуватися за допомогою так званого процесу бактеріальна трансформація. Плазміди вводяться в бактеріальну клітину, таку як Е. coli, і клітини з новими сегментами ДНК почнуть виробляти копії та відповідні білки.

При бактеріальній трансформації клітини-господарі та плазміди інкубуються разом при температурі тіла протягом приблизно 12 годин. Клітини поглинають частину плазмід і розглядають їх як власну плазмідну ДНК.

Збір клонованої ДНК та білків: Більшість плазмід, що використовуються для клонування ДНК, мають гени стійкості до антибіотиків включені в їх ДНК. Оскільки бактеріальні клітини поглинають нові плазміди, вони стають стійкими до антибіотиків.

При обробці культури антибіотиками виживають лише ті клітини, які поглинули нові плазміди. В результаті виходить чиста культура бактеріальних клітин з клонованою ДНК. Цю ДНК можна збирати або виробляти відповідний білок.

ПЛР метод простіший і копіює існуючу ДНК на місці. Це не вимагає різання ферментами обмеження або введення плазмідаДНК послідовності. Це робить його особливо придатним для клонування зразків ДНК з обмеженою кількістю ланцюгів ДНК. Хоча метод може клонувати ДНК, він не може бути використаний для виробництва відповідного білка.

Розкриття ланцюгів ДНК: ДНК у хромосомах щільно згорнута у структуру подвійної спіралі. Нагрівання ДНК до 96 градусів Цельсія в процесі, який називається денатурація змушує молекулу ДНК розмотуватися і розділятися на дві нитки. Це розділення потрібно, оскільки одночасно можна клонувати лише одну нитку ДНК.

Вибір праймерів: Як і при клонуванні ДНК плазмідного вектора, послідовності ДНК, які потрібно клонувати, слід ідентифікувати з особливим акцентом на початку та кінцях сегментів ДНК. Праймери - це ферменти, які приєднуються до специфічних кодових послідовностей ДНК, і їх потрібно відібрати для позначення цільових сегментів ДНК. Праві праймери прикріпляться до послідовностей молекул ДНК, щоб позначити початок і кінець цільових сегментів.

Відпал реакції на зв'язування праймерів: Викликається охолодження реакції до приблизно 55 градусів Цельсія відпал. Коли реакція охолоджується, праймери активуються і прикріплюються до ланцюга ДНК на кожному кінці цільового сегмента ДНК. Праймери діють лише як маркери, і ланцюг ДНК не потрібно обрізати.

Виробництво ідентичних копій цільового сегмента ДНК: У процесі під назвою розширення, до реакції додається термочутливий фермент TAQ-полімераза. Потім реакцію нагрівають до 72 градусів Цельсія, активуючи фермент. Активний фермент ДНК-полімерази зв’язується з праймерами і копіює послідовність ДНК між ними. Початковий процес секвенування та клонування ДНК завершено.

Збільшення виходу клонованої ДНК: Початковий процес відпалу та розширення створює відносно мало копій доступних сегментів ланцюга ДНК. Для збільшення виходу за рахунок додаткової реплікації ДНК реакцію знову охолоджують, щоб повторно активувати праймери і дати їм зв’язатися з іншими ланцюгами ДНК.

Потім, повторне нагрівання реакції знову активує фермент полімерази, і виробляється більше копій. Цей цикл можна повторити від 25 до 30 разів.

Метод плазмідного вектора покладається на достатній початковий запас ДНК для розрізання та вставки в плазміди. Занадто мало вихідної ДНК призводить до зменшення кількості плазмід і повільного початку клонованого виробництва ДНК.

Метод ПЛР може виробляти велику кількість ДНК з кількох вихідних ланцюгів ДНК, але оскільки ДНК не імплантується в бактеріальну клітину, виробництво білка неможливе.

Для отримання білка, кодованого у фрагментах ДНК, який потрібно клонувати з невеликого початкового зразка ДНК, ці два методи можна використовувати разом, і вони можуть доповнюють одне одного. Спочатку метод ПЛР використовується для клонування ДНК з невеликого зразка та отримання багатьох копій.

Потім продукти ПЛР використовуються методом плазмідного вектора для імплантації продукованої ДНК в бактеріальні клітини, які вироблятимуть бажаний білок.

Молекулярна біологія використовує клонування генів та реплікацію ДНК у медичних та комерційних цілях. Бактерії з клонованими послідовностями ДНК використовуються для виробництва ліків та заміщення речовин, які люди з генетичними порушеннями не можуть виробляти самі.

Типове використання включає:

• Ген для людський інсулін клонується в бактерії, які потім виробляють інсулін, який використовується діабетиками.
• Активатор тканинного плазміногену виробляється з клонованої ДНК і використовується для допомоги запобігати утворенню тромбів.
• Гормон росту людини можна виробляти та вводити людям, які не можуть його виготовити самостійно.

Біотехнологія також використовує клонування генів у сільському господарстві для створення нових характеристик у рослин і тварин або посилення існуючих характеристик. У міру клонування більшої кількості генів кількість можливих застосувань збільшується в геометричній прогресії.

Молекули ДНК складають невелику частку матеріалу в живій клітині, і важко виділити вплив багатьох генів. Методи клонування ДНК доставляють велику кількість певної послідовності ДНК для вивчення, і ДНК виробляє білки так само, як це було у вихідній клітині. Клонування ДНК дає можливість вивчати цю операцію для різних генів ізольовано.

Типові дослідження та застосування ДНК-технологій включають вивчення:

• Функція гена.
• Мутації гена.
• Експресія гена.
• Генні продукти.
• Генетичні вади.

Коли клонується більше послідовностей ДНК, легше знаходити та клонувати додаткові послідовності. Існуючі клоновані сегменти ДНК можна використовувати, щоб визначити, чи відповідає новий сегмент старому і які частини відрізняються. Тоді ідентифікація послідовності ДНК-мішені відбувається швидше та точніше.

В генна терапія, клонований ген представлений клітинам організму, природний ген якого пошкоджений. Життєво важливий ген, який виробляє білок, необхідний для певної функції організму, може бути мутованим, зміненим радіацією або порушеним вірусами.

Коли ген не працює належним чином, у клітині відсутня важлива речовина. Генна терапія намагається замінити ген клонованою версією, яка буде виробляти необхідну речовину.

Генна терапія все ще є експериментальною, і мало пацієнтів вилікували за допомогою цієї методики. Проблеми полягають у визначенні єдиного гена, відповідального за стан здоров’я, та доставці багатьох копій гена до потрібних клітин. Оскільки клонування ДНК набуває все більшого поширення, генна терапія застосовується в декількох конкретних ситуаціях.

Останні успішні програми включали:

• Хвороба Паркінсона: Використовуючи вірус як вектор, ген, пов’язаний із хворобою Паркінсона, вводили у середній мозок пацієнтів. Пацієнти відчували покращення рухових навичок без будь-яких побічних побічних ефектів.
• Дефіцит аденозиндезамінази (ADA): Генетичний імунний розлад лікували шляхом видалення стовбурових клітин крові пацієнтів та вставки гена ADA. В результаті пацієнти змогли продукувати принаймні деякі власні ADA.
• Гемофілія: Люди з гемофілією не виробляють специфічних білків, які допомагають згортанню крові. Ген продукування одного з відсутніх білків був введений в клітини печінки пацієнтів. Пацієнти виробляли білок, а випадки кровотечі зменшувались.

Генна терапія є одним із найперспективніших застосувань клонування ДНК, але інші нові способи використання, ймовірно, будуть розмножуватися, оскільки вивчається все більше послідовностей ДНК та визначається їх функція. Клонування ДНК постачає сировину для генної інженерії у необхідних кількостях.

Коли роль генів відома і їх правильна функція може бути забезпечена шляхом заміни дефектних гени, багато хронічних захворювань і навіть рак можна атакувати та лікувати на генетичному рівні за допомогою ДНК технології.

Пов’язаний вміст:

• Характеристика колонії кишкової палички (кишкової палички)
• РНК: визначення, функція, структура