Вестерн-блот, аналітична методика, яка використовується для визначення конкретного білка в даному зразку, використовує здатність ферменту або міченого флуоресценцією первинного антитіла зв'язуватися зі своїм специфічним антигеном. Це триетапний процес, що починається з гель-електрофорезу, після чого проводиться блот-мембрана та зондування антитілами. Виявлення білка може бути прямим або непрямим, причому в останньому використовується мічене вторинне антитіло, спрямоване проти первинного. Хоча вестерн-блот прийнятий як звичайний метод аналізу білка, він має як обмеження, так і переваги.
Перевага: Чутливість
Одним з найбільших аргументів на користь вестерн-блот є його чутливість. Завдяки своїй здатності виявляти лише 0,1 нанограма білка у зразку, ця методика теоретично може слугувати ефективний засіб ранньої діагностики, що виявляє навіть найменшу імуногенну реакцію вірусу чи бактерії у пацієнта зразок. Непрямий вестерн-блот додатково спирається на цю чутливість завдяки здатності вторинного антитіла посилювати інтенсивність сигналу, виявленого системою візуалізації. Більша чутливість означає, що для тестування потрібно менше антитіл, що значно скорочує лабораторні витрати.
Перевага: Специфічність
Техніка вестерн-блот обумовлена своєю специфікою двома великими чинниками, що сприяють цьому. Спочатку гель-електрофорез сортує зразок на білки різного розміру, заряду та конформації. Цей процес сам по собі є величезним кроком до виявлення, оскільки смуги, утворені в гелі, вже дають підказки про розмір білка або поліпептиду, що нас цікавить. Специфічність взаємодії антитіло-антиген є другим великим фактором. Оскільки специфічні антитіла виявляють спорідненість до конкретних білків, процес може вибірково виявляти цільовий білок навіть у суміші з 300 000 різних білків.
Недолік: схильність до помилкових або суб’єктивних результатів
Незважаючи на свою чутливість та специфічність, вестерн-пляма все одно може дати помилкові результати. Помилково позитивні результати, коли антитіло реагує з нецільовим білком, що часто трапляється, коли у пацієнта, який тестується на ВІЛ, виявляється туберкульоз або ряд паразитарних інфекції. З іншого боку, помилково негативний результат може бути легким, якщо більшим білкам не надається достатньо часу для правильного перенесення на мембрану. Неправильне промокання та обробка часто дають перекошені, вицвілі або навіть кілька смуг, що робить результати випробувань предметом інтерпретації фахівця.
Недолік: висока вартість і технічний попит
Вартість вестерн-блот - це сукупність великих індивідуальних витрат на мічені антитіла, кваліфікованих аналітиків та лабораторне обладнання. Делікатний процес, вестерн-блот, вимагає точності на кожному кроці для належної ідентифікації складових зразка. Незначна помилка концентрації реагенту або інкубаційного періоду може бути згубною для всього процесу. Нарешті, обладнання, необхідне для виявлення та візуалізації - хемілюмінесцентні, флуоресцентні, радіоактивні чи лазерні системи виявлення - може бути занадто дорогим для середнього мікробіологічного підрозділу.