Молекулярне клонування - загальноприйнятий біотехнологічний метод, з яким повинен бути знайомий кожен студент і дослідник. Молекулярне клонування з використанням типу ферменту, який називається ферментом рестрикції, для розрізання ДНК людини на фрагменти, які потім можна вставити в плазмідну ДНК бактеріальної клітини. Ферменти обмеження розрізають дволанцюжкову ДНК навпіл. Залежно від ферменту рестрикції, розріз може призвести або до липкого кінця, або до тупого кінця. Липкі кінці є більш корисними для молекулярного клонування, оскільки вони забезпечують вставлення фрагмента ДНК людини в плазміду в правильному напрямку. Процес перев’язки або злиття фрагментів ДНК вимагає менше ДНК, коли у ДНК є липкі кінці. Нарешті, кілька ферментів рестрикції з липким кінцем можуть виробляти той самий липкий кінець, хоча кожен фермент розпізнає іншу послідовність рестрикції. Це збільшує ймовірність того, що область, що представляє інтерес для ДНК, може бути вирізана липкими кінцевими ферментами.
Ферменти обмеження та сайти обмеження
Рестрикційні ферменти - це ферменти, які розрізають розпізнають специфічні послідовності на дволанцюжковій ДНК і розрізають ДНК навпіл у цій послідовності. Розпізнана послідовність називається сайтом рестрикції. Рестрикційні ферменти називаються ендонуклеазами, оскільки вони розрізають дволанцюжкову ДНК, як саме існує ДНК, в місцях, що знаходяться між кінцями ДНК. Існує більше 90 різних ферментів рестрикції. Кожен розпізнає окремий сайт обмежень. Рестрикційні ферменти розщеплюють свої відповідні сайти рестрикції в 5000 разів ефективніше, ніж інші сайти, які вони не розпізнають.
Правильна орієнтація
Ферменти обмеження бувають двох загальних класів. Вони або розрізають ДНК на липкі кінці, або на тупі. Липкий кінець має коротку область нуклеотидів, будівельних блоків ДНК, тобто неспарену. Цей непарний регіон називається звисом. Кажуть, що звис липкий, тому що він хоче і буде поєднуватися з іншим липким кінцем, який має додаткову послідовність звису. Липкі кінчики схожі на давно загублених близнюків, які прагнуть міцно обійняти один одного, як тільки зустрінуться. З іншого боку, тупі кінці не липкі, оскільки всі нуклеотиди вже спарені між двома ланцюгами ДНК. Перевага липких кінців полягає в тому, що фрагмент людської ДНК може поміститися в бактеріальну плазміду лише в одному напрямку. На відміну від цього, якщо і ДНК людини, і бактеріальна плазміда мають тупі кінці, ДНК людини може бути вставлена в плазміду головою до хвоста або хвостом до голови.
Лігуючий липкий кінець вимагає менше ДНК
Хоча ДНК з кінцевими паличками легше знаходити одне одного через свою “липкість”, ні липкі кінці, ні тупі кінці не можуть злитися в суцільний шматок ДНК. Для утворення безперервного шматка ДНК, який повністю пов'язаний, потрібен фермент, який називається лігаза. Лігаси з'єднують кістяк нуклеотидів на липких або тупих кінцях, в результаті чого утворюється суцільний ланцюг нуклеотидів. Оскільки липкі кінці швидше знаходять одне одного через їх тяжіння одне до одного, для процесу перев’язки потрібно менше людської ДНК і менше плазмідної ДНК. Тупі кінці ДНК і плазміди рідше знаходять одне одного, і тому лігування тупих кінців вимагає введення в пробірку більше ДНК.
Різні ферменти можуть дати однаковий липкий кінець
Місця обмеження розташовані по всьому геному організмів, але розташовані не рівномірно. У плазмідах вони можуть бути сконструйовані так, щоб вони знаходились безпосередньо поруч. Вчені, які хочуть вирізати фрагмент людської ДНК з геному людини, повинні знайти місця рестрикції, які знаходяться спереду і ззаду області фрагмента. На додаток до того, щоб забезпечити вставлення фрагмента ДНК у правильному напрямку, різні липкі кінцеві ферменти можуть створювати однаковий липкий кінець, хоча вони розпізнають різні послідовності рестрикції. Наприклад, BamHI, BglII та Sau3A мають різні послідовності розпізнавання, але виробляють однаковий липкий кінець GATC. Це збільшує ймовірність того, що з’являться липкі кінцеві сайти обмеження, які фланкують ваш людський ген, що вас цікавить.