Джерело обмежувальних ферментів

З моменту відкриття рестрикційних ферментів галузь молекулярної біології швидко прогресувала завдяки унікальній здатності цих білків специфічно розщеплювати ДНК. Ці прості ферменти мали глибокий вплив на дослідження у всьому світі; як не дивно, але ми маємо бактерії, щоб подякувати за цей науковий дар.

Рестрикційні ферменти, також звані рестрикційними ендонуклеазами, зв'язуються з ДНК і розщеплюють подвійну ланцюг, утворюючи менші шматочки ДНК. Існує три типи ферментів рестрикції; Ферменти рестрикції типу I розпізнають послідовність ДНК і випадковим чином розрізають нитку на відстані більше тисячі пар основ від ділянки. Ферменти рестрикції типу II, найбільш корисні для лабораторій молекулярної біології, розпізнають і розрізають ланцюг ДНК передбачувано у певній послідовності, яка, як правило, менше десяти пар основ. Ферменти рестрикції типу III подібні до типу I, але вони вирізають ДНК близько тридцяти пар основ з послідовності розпізнавання.

Види бактерій є основним джерелом комерційних ферментів рестрикції. Ці ферменти служать для захисту клітин бактерій від вторгнення чужорідної ДНК, таких як послідовності нуклеїнових кислот, що використовуються вірусами для реплікації всередині клітини-хазяїна. В основному, фермент буде подрібнювати ДНК на набагато менші шматочки, які представляють незначну небезпеку для клітини. Ферменти названі за видами та штамом бактерій, які його продукують. Наприклад, перший рестрикційний фермент, витягнутий із штаму Escherichia coli RY13, називається EcoRI, а п'ятий фермент, екстрагований з того ж виду, називається EcoRV.

Застосування ферментів рестрикції типу II є майже універсальним у лабораторіях по всьому світу. Молекули ДНК надзвичайно довгі, і ними важко правильно управляти, особливо якщо дослідника цікавить лише один або два гени. Ферменти обмеження дозволяють вченому надійно розрізати ДНК на значно менші порції. Ця здатність маніпулювати ДНК дозволила прогресувати картографічне обмеження та молекулярне клонування.

У лабораторних умовах знання, де саме знаходяться певні місця рестрикції на ланцюзі ДНК, є надзвичайно корисним і зручним. Якщо послідовність ДНК відома, картографування рестрикцій можна зробити за допомогою комп’ютера, який може швидко відобразити всі можливі послідовності розпізнавання ферментів рестрикції. Якщо послідовність ДНК невідома, дослідник все ще може створити загальну карту, використовуючи різні ферменти самі по собі та спільно з іншими ферментами для розщеплення молекули. За допомогою дедуктивних міркувань можна створити загальну карту обмежень. Наявність карти обмежень є критичним фактором при клонуванні генів.

Молекулярне клонування - це лабораторна техніка, при якій ген вирізається з цільової молекули ДНК, яка зазвичай витягується з організму, ферментами рестрикції. Далі ген вбудовується в молекулу, звану вектором, яка зазвичай являє собою невеликі шматочки кругові ДНК, звані плазмідами, які були модифіковані, щоб нести декілька цільових ферментів рестрикції послідовності. Вектор розщеплюється рестрикційними ферментами, а потім ген вставляється в кругову ДНК. Потім фермент, який називається ДНК-лігаза, може реформувати коло, включаючи ген-мішень. Як тільки ген буде «клонований» таким чином, вектор може бути вставлений в бактеріальну клітину, щоб ген міг продукувати білок.