Вестерн-блот - одна з найпоширеніших процедур у біохімічних лабораторіях. В основному він відокремлює білки від зразка за розміром, а потім тестує з використанням антитіл, щоб визначити, чи присутній даний білок. Це корисно не тільки в наукових дослідженнях, але і в медичних або діагностичних лабораторіях; Наприклад, тести як на ВІЛ, так і на хворобу Лайма включають тест на імуноферментний аналіз (ІФА), а потім Вестерн-блот, якщо тест ІФА позитивний. Однак, незважаючи на свою популярність, вестерн-блот має ряд недоліків.
Кількісний
Класичні вестерн-клякси не є кількісними. Іншими словами, хоча вони можуть сказати дослідникам, чи присутній певний білок, вони не дають можливості кількісно визначити, яка кількість білка присутня. Зараз деякі біотехнологічні компанії продають набори, які дозволяють дослідникам або лаборантам кількісно визначити кількість білок, присутній із використанням стандартної кривої - але це працює, лише якщо є чисті зразки того самого білка доступні. Більше того, молекулярну масу білка можна оцінити лише за допомогою Вестерн-блот, а не визначити точно, як за допомогою мас-спектрометрії.
Антитіла
Вестерн-блот можна проводити лише за наявності первинних антитіл проти цікавого білка. Хоча антитіла до багатьох різних білків можна придбати у біотехнологічних компаній, вони коштують недешево; якщо первинні антитіла недоступні для даного білка, неможливо буде виконати вестерн-блот у пошуках цього конкретного білка. Більше того, дослідники можуть захотіти визначити, чи був білок якимось чином модифікований - чи був він фосфорильований (мав фосфатна група, приєднана до неї), наприклад - і за допомогою методики Вестерн-блот їм потрібні антитіла, специфічні для модифікованих білка.
Навчання
Правильно виконати вестерн-блот і отримати хороші результати може бути складно, тому персонал повинен бути добре навченим. У цьому, як і в багатьох інших справах, досвід є, мабуть, найкращим репетитором; навіть для досвідченого техніка вестерн-блот вимагає багато часу. Наприклад, частина експерименту з гелевим електрофорезом, як правило, триває від однієї до двох годин. Звичайно, під час роботи гелю можна виконувати й інші завдання, але для отримання результатів експеримент все ж займає досить багато часу.
Інші обмеження
Антитіла іноді можуть виявляти деяке нецільове зв'язування, що може призвести до гірших результатів. Більше того, при вестерн-блоттінгу ви використовуєте антитіло проти певного білка, тому ваші результати покажуть вам, лише чи був цей білок. Мас-спектрометрія з високою роздільною здатністю, навпаки, виявляє всі білки, присутні у зразку, і на відміну від класичного Вестерн-блоттінгу воно є кількісним. Важливо пам’ятати, звичайно, що мас-спектрометрія набагато дорожча, а також технічно складніша у використанні порівняно із вестерн-блот.