Генетичний план клітини кодується в її генетичному матеріалі або ДНК. Оскільки ДНК ніколи не залишає ядро клітини, для того, щоб ця інформація потрапляла в цитоплазму деінде білки та біохімічні компоненти, необхідно спочатку транскрибувати ДНК в РНК-передавач (мРНК або полі (А) РНК). Потім ця мРНК перетворюється на білки, які виконують багато функцій клітини. Щоб виявити або кількісно визначити дуже рідкісні мРНК, зробити зонди для мікрочипів або побудувати бібліотеки комплементарних молекул ДНК, мРНК потрібно ізолювати. Однак екстракція загальної РНК (тобто всі РНК у клітині) та подальша ізоляція мРНК не є взаємовиключними процесами; перше повинно бути виконано для того, щоб мРНК була вилучена.
Гомогенізація TRIzol: загальна РНК включає всю мРНК, передавальну РНК, рибосомну РНК та інші некодирующие РНК. Щоб відокремити їх від інших клітинних компонентів, клітина спочатку відкривається, щоб звільнити свою вмісту. Це робиться шляхом ресуспендування клітин, осаджених центрифугуванням (обертання на високих швидкостях) у реагенті TRIzol (Life Technologies). Інші версії TRIzol (наприклад, реагент TRI від Ambion) працюють аналогічно.
Повне виділення РНК: серія центрифугувань використовується для розділення різних компонентів (білків, ДНК, РНК) клітини на шари або фази всередині суспензії. Верхня фаза жовтого кольору складається з жиру і може бути відкинута. Бажана фаза підфарбована в червоний колір, містить загальну РНК і зберігається. Після проведення фенол-хлороформної екстракції та серії промивань спиртом із використанням ізопропанолу та етанолу РНК можна гранулювати для виділення мРНК. Додайте інгібітори РНКази, щоб запобігти розщепленню цього ферменту загальної РНК.
Вилучення мРНК: загальноприйнятим є набір для ізоляції мРНК, оскільки саморобні лабораторні протоколи не генерують великих кількостей високоочищених мРНК. Комерційні набори включають FastTrack 2.0 Invitrogen або Poly (A) чисту мРНК ізоляцію Ambion's Комплект. Ці основні кроки є загальними для таких наборів:
г) Центрифугують цей зразок і відновлюють супернатант, який промивають кілька разів у серії зв'язуючих і малосольних буферів, передбачених у наборах.
Список літератури
- "Бібліотечні протоколи кДНК?"; Ян Г. Коуелл і Керолайн А. Остін; 1997
- "Протоколи транскрипції та перекладу in vitro?"; Мартін Дж. Тимми; 1995
Поради
- Зберігайте всі реагенти, клітини та РНК холодними, занурюючи в лід. Це запобігає розщепленню РНК будь-якими іншими ферментами, які виділяються в процесі гомогенізації.
Попередження
- Такі реагенти, як TRIzol, токсичні і не повинні контактувати зі шкірою або слизовими оболонками. Завжди дотримуйтесь безпечних лабораторних протоколів при роботі з цим реагентом.
Про автора
Палмер Овунг має ступінь магістра мистецтв з міжнародного бізнесу в Каліфорнійському університеті в Сан-Дієго та Бакалавр мистецтв з соціології в Університеті Каліфорнії в Санта-Барбарі і є навченим молекулярним агентом біолог. Він є вільним письменником з 2006 року. Окрім того, що він пише, він є штатним трейдером Forex та Інтернет-маркетингом.
Фото кредити
Jupiterimages / Photos.com / Getty Images