За даними веб-сайту BioWeb Університету Вісконсіна, ПЛР-праймер - це короткий синтетичний олігонуклеотид (зазвичай між 18 до 25 основ), що використовується для ампліфікації конкретних областей ДНК у техніці молекулярної біології, відомої як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). Потрібні як прямий, так і зворотний праймер, призначений бути зворотними комплементами ланцюга ДНК, щоб фланкувати і зв’язатися з потрібною областю ДНК. Коли вчені хочуть провести дослідження певного гена або області ДНК, їм спочатку потрібно провести ПЛР, щоб отримати достатньо цільової області, з якою можна працювати. Розробка послідовностей праймерів для регіону, що цікавить, може знадобитися, якщо вони ще не доступні в рамках раніше опублікованих досліджень або комерційних засобів.
Отримайте нуклеотидну послідовність гена чи області ДНК, що цікавить, і вирішіть, як довго фрагмент ви хочете ампліфікувати. Прямий і зворотний праймер призначений для зв’язування на початку і в кінці потрібного фрагмента. Як правило, звичайні методи ПЛР використовують праймери, які фланкують область довжиною від 100 до 1000 пар основ, тоді як методи ПЛР у реальному часі використовують фрагменти довжиною приблизно від 50 до 200 пар основ.
Визначтесь, де в послідовності ви хочете, щоб лежали праймери. Наприклад, вам може знадобитися розташування поблизу 5 'або 3' кінця послідовності або посередині. За бажанням вкажіть розташування праймерів, що охоплюють інтрон.
Розробити грунтовки довжиною від 18 до 24 основ. Вінсент Р. Преціозо, доктор філософії, з Brinkmann Instruments Inc., припускає, що ця довжина досить довга, щоб бути надзвичайно специфічною для бажаної області ДНК, але досить коротка, щоб легко зв’язувати (відпалювати). Температура плавлення грунтовки (Tm) повинна бути від 55 до 80 градусів Цельсія, досить низька, щоб забезпечити повне плавлення при або вище 90 градусів Цельсія, але досить висока, щоб забезпечити відпал. Вміст ГХ (відсоток Г і С в послідовності) повинен становити від 40 до 60 відсотків. 3 'кінець послідовності праймерів повинен закінчуватися C або G (званий затискачем GC), щоб сприяти зв'язуванню, оскільки G і C нуклеотиди мають міцніші зв’язки, однак уникайте наявності трьох або більше Gs або Cs в останніх п’яти підставах послідовності.
Уникайте повторень чотирьох або більше однієї основи (наприклад, ACCCC ...) або чотирьох або більше повторів з нуклеотидами (наприклад, ATATATAT ...), оскільки вони можуть спричинити помилкову постановку. Розробити праймери без гомології внутрішнього ґрунтування (більше трьох основ, які доповнюють одну сам праймер) або міжгрунтову гомологію (де прямий та зворотний праймери мають доповнення послідовності). Це може спричинити самодимери або праймери-димери, де праймери зв'язуються самі з собою, замість того, щоб зв'язуватися з бажаною послідовністю ДНК.
Використовуйте Інтернет-ресурси та веб-сайти, які допомагають у розробці праймерів або допомагають перевірити послідовність праймерів на предмет самодоповнення або можливості виготовлення вторинних конструкцій, таких як шпильки. Деякі веб-сайти з проектування праймерів включають Масачусетський технологічний інститут Primer3, Національний центр біотехнологічної інформації Primer-Blast та Integrated DNA Technologies OligoAnalyzer.
