При роботі з високоефективною рідинною хроматографією (ВЕРХ) хороша калібрування є абсолютно важливою для забезпечення надійних якісних результатів. Правильне калібрування приладу ВЕРХ починається з вироблення відповідного еталону калібрування. У більшості випадків калібрування насправді вимагає ряду стандартів збільшення концентрації для того, щоб отримати так звану калібрувальну криву. Це побудована лінія та пов’язане рівняння, яке описує взаємозв’язок між концентрацією хімічної речовини, що тестується, та реакцією детектора ВЕРХ.
Визначте хімічну речовину, яку ви хочете випробувати для використання за допомогою ВЕРХ («аналіту»). Наприклад, можливо, ви захочете протестувати серію безалкогольних напоїв на вміст фруктози, і в цьому випадку аналітом буде фруктоза.
Отримайте кількість аналізованого речовини належної чистоти. Зазвичай чистота повинна бути вище 99%, а аналіт слід купувати в авторитетній компанії з постачання хімічних речовин. Наприклад, у випадку з фруктозою, ви купуєте чисту фруктозу у продавця хімічної продукції, а не в продуктовому магазині.
Визначте максимальну та мінімальну передбачувану концентрацію аналіту у зразках, які ви збираєтеся перевірити на ВЕРХ. У разі безалкогольних напоїв ви вивчаєте етикетки напоїв і визначаєте найнижчий і найвищий вміст фруктози серед напоїв, які ви тестуєте. Майте на увазі, що початкова проба (безалкогольний напій) може бути розведена або маніпулювати іншим способом під час підготовки до аналізу (залежно від використовуваного методу ВЕРХ) і, отже, може бути концентрація аналіту у зразках, які фактично вводять у ВЕРХ модифікований. Необхідно враховувати концентрацію аналіту у зразках при ВЕРХ.
Визначте розчинник, у якому ви будете розчиняти аналіт, щоб скласти стандарти калібрування. Цей розчинник повинен мати можливість належного розчинення аналіту у відносно широкому діапазоні концентрацій (принаймні настільки ж високому, як у зразках, які ви маєте намір перевірити). Крім того, цей розчинник в ідеалі повинен бути досить схожий на "мобільну фазу": розчинник, який використовується для перенесення зразків через прилад ВЕРХ.
Обчисліть кількість аналіту, необхідного для приготування "стандартного" розчину аналіту. Це виявляється шляхом множення необхідної концентрації стандартного запасу на бажаний об’єм. Концентрація аналіту в цьому розчині повинна бути принаймні на 10% вищою, ніж найвища передбачувана концентрація зразка. Якщо найвища передбачувана концентрація фруктози у зразку безалкогольного напою становить 8 грам / 100 мілілітрів, тоді стандартний стандарт може бути досягнутий до концентрації 10 грамів фруктози / 100 мілілітрів. Розумний об’єм становить 500 мілілітрів, отже, потрібно 8/100 мл х 500 мл = 40 грамів фруктози.
Зважте необхідну кількість аналіту з належною точністю. Часто підходить значення ваги в грамах з точністю до одного або двох знаків після коми, але для деяких методів може знадобитися більша точність.
Переносять зважений аналіт в мірну колбу необхідного об'єму і додають бажаний розчинник до мітки заповнення колби. Використання мірної колби (а не градуйованої мензурки, наприклад) підвищує точність значення стандартної концентрації запасу. Переконайтеся, що весь аналіт переноситься в колбу; за потреби використовуйте трохи розчинника, щоб промити його.
Зробіть серію різних розведень основного стандарту, переклавши відомі обсяги основного стандарту в мірні колби, використовуючи піпетки для точного перенесення, потім додаючи розчинник. Найнижча стандартна концентрація повинна бути нижче найнижчої очікуваної проби для аналізу. У прикладі безалкогольного напою, якщо найнижча очікувана концентрація фруктози у зразку становить 2 грами / 100 мл, тоді можна зробити стандарт 1 грам / 100 мл. Це було б зроблено шляхом десятикратного розведення стандартного запасу. Стандартна серія повинна включати загалом 5 або 6 концентрацій, тому будуть потрібні додаткові розведення для отримання норм, можливо, 3, 5 і 8 грамів фруктози / мл. Тепер у вас є ряд стандартних рішень, за допомогою яких можна калібрувати ВЕРХ.