Ферменти мають визначену тривимірну структуру. Будь-яка зміна цієї структури спричиняє зміну активності ферменту. РН реакційної суміші змінює цю структуру і, отже, активність. Кожен фермент має оптимальний рН, де він виявляє максимальну активність. Значні відмінності від цього рН викликають зміни тривимірної структури ферменту, що знижують його активність. Фермент катехол-оксидази має оптимальний рН близько 7.
Про катехол-оксидазу
Катехол окислюється катехол-оксидазою в присутності кисню з утворенням бензохінону, який під впливом повітря утворює меланін. Цей фермент також відомий під іншими назвами, наприклад, тирозиназа, дифенол оксидаза та поліфенол оксидаза. Картопля, яблука та банани містять катехол-оксидазу, яка діє на безбарвний катехол і перетворює його на меланін коричневого кольору. Підрум’янення, яке виникає, коли ви вирізаєте і виставляєте ці предмети на повітрі, є результатом цієї реакції.
Екстракція катехол-оксидази
Катехол-оксидазу можна отримати з бананів або картоплі. Розтерти банан з подвійним об’ємом води в ступці. Як варіант, змішайте банан з водою, щоб отримати екстракт катехол-оксидази. Процідити через масло муслін і зберігати в холодильнику. Якщо ви використовуєте картоплю, очищаєте та шматуєте її, то змішуйте на високій швидкості, використовуючи 700 мл холодної, дистильованої води. Процідіть цей картопляний сік через марлю і поставте в холодильник.
Деталі експерименту
Приготуйте буферні розчини зі значеннями рН 2, 4, 6, 7 і 8. Позначте п’ять пробірок цими значеннями рН. Наповніть кожну пробірку до однієї четвертої ємності відповідним буфером. Додайте в кожну з цих пробірок 10 крапель екстракту катехол-оксидази, а потім 10 крапель катехолу. Струсіть пробірки та запишіть колір кожної пробірки за шкалою від 0 до 5, де 0 означає відсутність кольору, а 5 - темний, коричневий колір. Продовжуйте струшувати пробірки і зазначайте колір кожні п’ять хвилин протягом наступних 20 хвилин.
Інтерпретація результату
Використовуйте дані, отримані вами за 20-хвилинне читання, для побудови графіку. На осі X вкажіть рН буферів. На осі Y вкажіть інтенсивність кольору від 0 до 5. Для кожного значення рН позначте інтенсивність кольору та приєднайте ці позначення для отримання кінцевого графіка. Знайдіть пік на цій ділянці та визначте оптимальний рН для реакції катехол-оксидази. За умови, що ви правильно провели експеримент, оптимальним значенням рН буде 7. При рН 7 фермент є найбільш активним і швидко каталізує окислення катехолу, надаючи темний, коричневий колір.
Запобіжні заходи
Банани, а також картопля містять катехол. Тому існує ймовірність того, що частина цього окиснюється під час реакції, сприяючи інтенсивності кольору, яку ви спостерігаєте. Щоб запобігти цій реакції, тримайте екстракт катехол-оксидази на брилі льоду, перш ніж додавати його в кожну пробірку. Катехол отруйний, тому переконайтеся, що ви не допускаєте його контакту з шкірою. Не пипетуйте розчини катехолу, і якщо є розлив, надіньте рукавички, щоб очистити його за допомогою паперових рушників.