Polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR, DNA'nın bir parçasını birçok parçaya kopyalayan bir tekniktir - katlanarak çok sayıda. PCR'deki ilk adım, DNA'yı denatüre olacak veya tek iplikler halinde eriyecek şekilde ısıtmaktır. DNA'nın yapısı, basamakların manyetik uçlu ipler olduğu bir ip merdiveni gibidir. Mıknatıslar, baz çiftleri adı verilen basamakları oluşturmak için bağlanır ve böylece ayrılmaya direnir. DNA'nın her parçası, farklı sıcaklıklarda tek iplikçikler halinde erir. DNA'nın yapısının DNA'nın tek tek parçaları tarafından nasıl bir arada tutulduğunu anlamak, bunun nedenine dair fikir verecektir. farklı DNA parçaları farklı sıcaklıklarda erir ve neden ilk aşamada bu kadar yüksek sıcaklıklara ihtiyaç duyulur? yer.
Erime! Erime!
PCR'nin ilk adımı, çift sarmallı DNA'nın tek sarmallı DNA'ya ayrılması için DNA'yı eritmektir. Memeli DNA'sı için bu ilk adım genellikle yaklaşık 95 derece Celcius (yaklaşık 200 Fahrenheit) ısı içerir. Bu sıcaklıkta, A-T ve G-C baz çiftleri arasındaki hidrojen bağları veya DNA merdivenindeki basamaklar, çift sarmallı DNA'nın fermuarını açarak parçalanır. Ancak sıcaklık, tek şeritleri veya merdivenin direklerini oluşturan fosfat-şeker omurgasını kıracak kadar sıcak değildir. Tek iplikçiklerin tamamen ayrılması, onları, primerler olarak adlandırılan kısa DNA parçalarının tek iplikçiklere bağlanmasına izin vermek için soğutma olan PCR'nin ikinci aşamasına hazırlar.
Manyetik Fermuarlar
DNA'nın 95 derece Celcius gibi yüksek bir sıcaklığa ısıtılmasının bir nedeni, DNA çift sarmalı ne kadar uzunsa, o kadar birlikte kalmak istemesidir. DNA uzunluğu, o DNA parçası üzerinde PCR için seçilen erime noktasını etkileyen bir faktördür. Çift sarmallı DNA'daki A-T ve G-C baz çiftleri, çift sarmallı yapıyı bir arada tutmak için birbirleriyle bağ kurar. İki tek iplik arasındaki ardışık baz çiftleri ne kadar çok bağlanırsa, komşuları da o kadar çok bağlanmak ister ve iki iplik arasındaki çekim o kadar güçlü olur. Küçük mıknatıslardan yapılmış bir fermuar gibidir. Fermuarı kapattığınızda, mıknatıslar doğal olarak fermuarını çekmek ve fermuarlı kalmak isteyecektir.
Daha Güçlü Mıknatıslar Daha Sıkı Yapışır
İlgilendiğiniz DNA parçası için hangi erime sıcaklığının seçileceğini etkileyen bir diğer faktör, o parçada bulunan G-C baz çiftlerinin miktarıdır. Her baz çifti birbirini çeken iki mini mıknatıs gibidir. G ve C'den oluşan bir çift, A ve T çiftinden çok daha güçlü bir şekilde çekilir. Bu nedenle, başka bir parçadan daha fazla G-C çiftine sahip bir DNA parçası, tek zincir halinde erimeden önce daha yüksek bir sıcaklığa ihtiyaç duyacaktır. DNA, ultraviyole ışığını doğal olarak emer - tam olarak 260 nanometre dalga boyunda - ve tek iplikli DNA, çift iplikli DNA'dan daha fazla ışık emer. Bu nedenle, emilen ışığın miktarını ölçmek, çift sarmallı DNA'nızın tek sarmal halinde ne kadar eridiğini ölçmenin bir yoludur. G-C ve A-T baz çiftlerinin "manyetik fermuar" etkisi, ışık emilimi grafiğine neden olan şeydir. sıcaklıktaki bir artışa karşı çizilen çift sarmallı DNA, sigmoidal olacak, S şeklinde olacak ve bir düz. S'nin eğrisi, baz çiftlerinin ayrılmak istemedikleri için ısıya karşı uyguladıkları takım çalışması direncini temsil eder.
Yarım Nokta
Bir DNA uzunluğunun tek iplikler halinde eridiği sıcaklığa erime sıcaklığı denir ve "Tm" kısaltması ile gösterilir. Bu, bir çözeltideki DNA'nın yarısının tek iplik halinde eridiği ve diğer yarısının hala çift iplik halinde olduğu sıcaklığı gösterir. form. Her DNA parçası için erime sıcaklığı farklıdır. Memeli DNA'sının G-C içeriği %40'tır, yani baz çiftlerinin kalan %60'ı As ve Ts'dir. %40 G-C içeriği, memeli DNA'sının 87 derece Celcius'ta (yaklaşık 189 Fahrenheit) erimesine neden olur. Bu nedenle, memeli DNA'sı üzerindeki PCR'nin ilk adımı, onu 94 dereceye (201 Fahrenheit) kadar ısıtmaktır. Erime sıcaklığından sadece yedi derece daha sıcak ve tüm çift iplikler tamamen eriyerek tek iplik haline gelecek.