Moleküler biyolojide, iyi bir tampon seçimi ve farklı DNA izolasyon adımları için hazırlık yapılabilir. protein ekspresyonuna geçmekle başlamak için başka bir maxi-prep kiti açmak arasındaki fark bitmiş. Çok önemli olmalarına rağmen, tampon tarifler genellikle tam da budur – farklı bileşenler için açıklama veya gerekçe olmadan yazılan tarifler. Böyle bir tampon, glukoz-tris-EDTA veya GTE tamponudur.
GTE Ne İçin Kullanılır?
GTE, hücreleri parçalamadan (kırarak) ve içindeki plazmit DNA'yı hasat etmeden önce bakteri hücre topaklarını yeniden süspanse etmek için kullanılır. Hücre zarlarını yumuşatan lizozim, genellikle GTE tamponu ile birlikte eklenir. Bu adım sırasında tüm hücrelerin homojen bir süspansiyonunu elde etmek, böylece sonradan eklenen lizis solüsyonunun tüm hücrelere ulaşması, iyi DNA verimi elde etmenin anahtarıdır. GTE, DNA için kararlı bir ortam sağlarken bunu yapmak için tasarlanmıştır.
Osmolarite için Glikoz
50 mM (milimolar) glikoz şekeri, hücrelerin dışındaki çözünen konsantrasyonun hücrelerin içindekine yakın olduğu yerde ozmolariteyi korumak için GTE tamponuna eklenir. Bu, agregasyon ve bozunma nedeniyle daha düşük DNA verimine neden olabilecek erken hücre lizizini önler. Tamponun diğer bileşenleri de çözeltinin ozmolaritesine katkıda bulunur, ancak glikoz, elektrolit olmaması iyi bir seçimdir çünkü solüsyonun tamponunu etkilemez özellikleri.
pH Kararlılığı için Tris
Tris, çok yaygın bir pH tamponu olan tris (hidroksimetil) aminometanın kısa adıdır. GTE tamponu durumunda, asit tuzu (Tris-HCl), tampona 25 mM'lik bir konsantrasyonda ilave edilir. Bu, çözeltinin pH'ını fizyolojik 8.0'a yakın bir değerde, plazmid DNA'nın asit hidrolizini (bozunmasını) ve diğer hücre bileşenlerinin istenmeyen yan reaksiyonlarını önlemek için ideal bir pH'ta tutar.
EDTA DNA Bozulmasını Önler
EDTA veya etilendiamintetraasetik asit, metal iyonlarını çözeltiden yakalar veya "şelatlar", istenmeyen yan reaksiyonlara katılmalarını önler. GTE tamponunda, EDTA 10mM'de eklenir. Birincil amacı, tamponda serbest çinko, magnezyum ve kalsiyumu yuvarlamak ve böylece bu metalleri gerektiren belirli yollarla DNA bozulmasını önlemektir.
Bazı Önemli İpuçları
GTE tamponunuzu soğuk tutun ve içinde istenmeyen bakterilerin büyümesini önlemek için küçük miktarlarda yapın. Şeker ve kontrollü pH, harika bir büyüme ortamı sağlar. Daima arıtılmış su kullanın. Musluk suyunda borulardan aşırı metal iyonları bulunabilir ve bu da EDTA'nın yakalama kabiliyetini zorlayabilir. Numunenizde enterferans yapan RNA'nın varlığından şüpheleniyorsanız, sorunu ortadan kaldırmak için GTE tamponunuza mililitrede 100 mikrogram RNase A ekleyin.