Bir hücrenin genetik planı, genetik materyalinde veya DNA'sında kodlanmıştır. DNA hiçbir zaman hücrenin çekirdeğini terk etmediğinden, bu bilginin diğer hücrelerin bulunduğu sitoplazmaya girebilmesi için proteinler ve biyokimyasal bileşenler bulunur, ilk önce DNA'yı haberci RNA'ya (mRNA veya poli (A)RNA). Bu mRNA daha sonra hücrenin birçok işlevini yerine getiren proteinlere çevrilir. Çok nadir mRNA'ları saptamak veya ölçmek, mikrodiziler için problar yapmak veya tamamlayıcı DNA moleküllerinin kitaplıklarını oluşturmak için mRNA'nın izole edilmesi gerekir. Ancak, toplam RNA (yani bir hücredeki tüm RNA) ekstraksiyonu ve ardından mRNA izolasyonu birbirini dışlayan süreçler değildir; mRNA'nın çıkarılması için ilkinin gerçekleştirilmesi gerekir.
TRIzol homojenizasyonu: Toplam RNA, tüm mRNA'yı, transfer RNA'yı, ribozomal RNA'yı ve diğer kodlamayanları içerir RNA'lar. Bunları diğer hücresel bileşenlerden ayırmak için, hücre önce kendi hücresini serbest bırakmak için açılır. içindekiler. Bu, TRIzol Reaktifinde (Life Technologies) santrifüjleme (yüksek hızlarda döndürme) ile peletlenen hücrelerin yeniden süspanse edilmesiyle yapılır. TRIzol'ün diğer sürümleri (Ambion'un TRI Reaktifi gibi) benzer şekilde çalışır.
Toplam RNA İzolasyonu: Hücrenin farklı bileşenlerini (proteinler, DNA, RNA) süspansiyon içindeki katmanlara veya fazlara ayırmak için bir dizi santrifüjleme kullanılır. Üst, sarı renkli faz yağdan oluşur ve atılabilir. İstenen faz kırmızı renktedir, toplam RNA'yı içerir ve korunur. Bir fenol-kloroform ekstraksiyonu ve izopropanol ve etanol kullanılarak bir dizi alkol yıkaması gerçekleştirdikten sonra, RNA, mRNA izolasyonu için peletlenebilir. Bu enzimin toplam RNA'yı bozmasını önlemek için RNase inhibitörleri ekleyin.
mRNA Ekstraksiyonu: Ev yapımı laboratuvar protokolleri büyük miktarlarda üretmediğinden mRNA'ları izole etmek için bir kit kullanmak yaygındır. yüksek oranda saflaştırılmış mRNA'lar. Ticari kitler arasında Invitrogen's FastTrack 2.0 veya Ambion's Poly (A)Pure mRNA İzolasyonu bulunur Kit. Bu temel adımlar, bu tür kitlerde ortaktır:
d) Bu numuneyi santrifüjleyin ve kitlerde sağlanan bir dizi bağlayıcı ve düşük tuz tamponunda birkaç kez yıkanan süpernatantı geri kazanın.
Referanslar
- "cDNA Kitaplığı Protokolleri?"; Ian G. Cowell ve Caroline A. Austin; 1997
- "In Vitro Transkripsiyon ve Çeviri Protokolleri?"; Martin J. Tims; 1995
İpuçları
- Buza daldırarak tüm reaktifleri, hücreleri ve RNA'yı soğuk tutun. Bu, RNA'nın homojenizasyon işlemi sırasında salınan diğer enzimler tarafından bozulmasını önler.
Uyarılar
- TRIzol gibi reaktifler toksiktir ve cilt veya mukoza zarlarıyla temas etmemelidir. Bu reaktifi kullanırken her zaman güvenli laboratuvar protokollerine uyun.
yazar hakkında
Palmer Owyoung, San Diego'daki California Üniversitesi'nden uluslararası işletme alanında yüksek lisans derecesine ve Santa Barbara'daki California Üniversitesi'nden sosyoloji alanında lisans derecesi ve eğitimli bir moleküler bilim adamıdır. biyolog. 2006 yılından beri serbest yazarlık yapmaktadır. Yazmaya ek olarak, tam zamanlı bir Forex tüccarı ve İnternet pazarlamacısıdır.
Fotoğrafa katkı verenler
Jupiterimages/Photos.com/Getty Images