Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE), çözeltideki proteinleri tanımlamanın biyokimyasal bir yöntemidir. Mathews ve arkadaşları tarafından "Biyokimya"da gösterildiği gibi, protein örnekleri ilk önce poliakrilamid jel bloğunun bir ucundaki "kuyulara" veya deliklere yüklenir. Daha sonra jele bir elektrik alanı uygulanır. Yüklenen numunelere eklenen SDS, proteinlerin doğal yükünü olumsuzlar. Bitesize Bio, bu nedenle, jelden pozitif yüklü kutba doğru hareket ederken proteinlerin göç hızını tek başına protein moleküler ağırlığı belirler, diyor Bitesize Bio. Aynı numunedeki çoklu proteinler bu nedenle birbirinden ayrılacak ve farklı pozisyonlara göç edecektir.
Jel fotoğrafını yönlendirin. "Üst", numunelerin orijinal olarak eklendiği kuyuların konumudur. "Alt", numunelerin göç ettiği yerdir ve çoğu zaman numunelerin göç eden cephesini gösteren boya cephesini içerir. Ya sol ya da sağ, tahmin edilebilir bir moleküler ağırlık kılavuzu olarak kullanılan bir "işaretçi" içermelidir.
Her şerit için örnekleri etiketleyin. Üst kısımda, kuyulara eklenen numuneler "şeritlerde" dikey olarak göç etmiş olacaktır. Bu nedenle, dikey bir sütunda görünen tüm çubuklar, doğrudan üzerine yüklenen bir numuneden geldi. Sütunları görselleştirmek zorsa, şeritlere kenarlıklar koymak için cetveli ve kalemi kullanın.
İşaret şeridindeki bantların moleküler boyutlarını etiketleyin. Ticari olarak temin edilebilen işaretleyiciler, her bir bandın moleküler ağırlıkları ile birlikte beklenecek bir bant modelinin bir resmi ile birlikte gelir. Bantlar, aslında jele gömülü olan lekeli protein olan koyu yatay "çubuklar"dır.
Her bir işaret bandından jelin karşı kenarına uzanan hafif yatay çizgiler çizin. Bu çizgileri kuyulara ve boya cephesine paralel yapmaya dikkat edin. Bu çizgiler, işaretleyici bantların her biri tarafından belirtilen moleküler ağırlıktaki proteinlerin her şeritte nerede konumlandırılacağını gösterir. Örneğin, 25 kilodaltondan uzanan çizginin hemen altında bulunan 4. kulvardaki bir bant işaretleyici bant, şerit 4 bandının moleküler düzeyde neredeyse 25 kilodalton olduğunu ancak oldukça olmadığını gösterir. ağırlık.
Tahmini moleküler ağırlığı ile her şeritteki her bandı etiketleyin. İşaretleyicileri kılavuz olarak kullanın ve işaret boyutları arasındaki değerleri tahmin edin.
Jel fotoğrafının altında, her şerit için bir "protein" listesi yapın. Kökeni veya koşulları gibi her numune hakkında bilinenleri belirterek başlayın. Ardından, şeritteki her bir bandın tahmini moleküler ağırlığını listeleyin. Tek bantlı şeritler, numunenin yalnızca bir protein içerdiğini gösterir. Çoklu bantlara sahip şeritler, çoklu proteinlerin varlığını gösterir. Göç cephesi ile çalışan bantlar, en yakın işaretçi tarafından önerilenden daha küçüktür ve işaretçinin belirttiği "daha küçük" olması dışında büyük olasılıkla tahmin edilemez.
Proteinler listesinde tuhaflıkları not edin. "Bulaşmış" bir görünüm, çok fazla proteinin mevcut olduğunu veya numunenin viskozitesinin göçünü etkilediğini gösterebilir. şeridin kenarı veya diğer bantlarla karşılaştırıldığında oldukça büyükse, bu proteinin konsantrasyonu muhtemelen çok yüksektir ve gelecekte seyreltilmelidir elektroforez. Şerit boyunca, arka plan jel renginden daha koyu olan grimsi bir renk tonu, ayırt edilemez protein parçalarını gösterir.
Her şeritteki proteinlerin kimliğini belirleyin. Bu sadece moleküler ağırlık kullanılarak yapılsa da, her bir şeridin kaynağı muhtemelen ipuçlarını da gösterecektir. Bazı koşullar altında proteinlerin bir jel üzerinde dimer veya trimer ilişkisini koruyabildiğini düşünün. Bu nedenle, bir protein bir jel üzerinde üç farklı bant olarak görünebilir. Proteinler tanımlanamasa bile, bantların nispi koyuluğu, çözeltideki proteinlerin konsantrasyonlarını gösterebilir. Meraklı ve bilinmeyen proteinler doğrudan orijinal jelden izole edilebilir ve tanımlama için gönderilebilir.
İhtiyacınız Olan Şeyler
- SDS-PAGE jelinin fotoğrafı, lekeli
- Kullanılan moleküler ağırlık belirteci için anahtar
- cetvel
- Dolma kalem