ขั้นตอนแรกในปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสคืออะไร?

ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสหรือ PCR เป็นเทคนิคที่ถ่ายสำเนาดีเอ็นเอหนึ่งส่วนออกเป็นหลายส่วน - จำนวนมากแบบทวีคูณ ขั้นตอนแรกอยู่ใน PCR คือการให้ความร้อนแก่ DNA เพื่อให้เกิดการเสื่อมสภาพหรือละลายเป็นเส้นเดียว โครงสร้างของ DNA เปรียบเสมือนบันไดเชือกที่ขั้นบันไดเป็นเชือกที่มีปลายแม่เหล็ก แม่เหล็กเชื่อมต่อกันเพื่อสร้างขั้น เรียกว่าคู่ฐาน ดังนั้นจึงต้านทานการแยกออกจากกัน ดีเอ็นเอแต่ละส่วนจะหลอมละลายเป็นสายเดี่ยวที่อุณหภูมิต่างกัน การทำความเข้าใจว่าโครงสร้างของ DNA ถูกประกอบเข้าด้วยกันโดยส่วนต่างๆ ของ DNA อย่างไร จะทำให้เข้าใจอย่างถ่องแท้ว่าทำไม ชิ้นส่วนดีเอ็นเอต่างๆ หลอมละลายที่อุณหภูมิต่างกัน และเหตุใดจึงต้องมีอุณหภูมิสูงเช่นนี้ในครั้งแรก สถานที่.

ขั้นตอนแรกของ PCR คือการละลาย DNA เพื่อให้ DNA ที่มีสายคู่แยกออกเป็น DNA สายเดี่ยว สำหรับ DNA ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม ขั้นตอนแรกนี้มักจะเกี่ยวข้องกับความร้อนประมาณ 95 องศาเซลเซียส (ประมาณ 200 องศาฟาเรนไฮต์) ที่อุณหภูมินี้ ไฮโดรเจนจะพันธะระหว่างคู่เบส AT และ G-C หรือขั้นบันไดใน DNA แยกออกจากกัน คลายซิป DNA ที่มีเกลียวสองเส้น อย่างไรก็ตาม อุณหภูมิไม่ร้อนพอที่จะทำลายกระดูกสันหลังของน้ำตาลฟอสเฟตที่ก่อตัวเป็นเส้นเดียวหรือเป็นเสาของบันได การแยกสายเดี่ยวโดยสมบูรณ์เตรียมพวกมันสำหรับขั้นตอนที่สองของ PCR ซึ่งกำลังเย็นลงเพื่อให้เศษ DNA สั้น ๆ ที่เรียกว่าไพรเมอร์จับสายเดี่ยว

เหตุผลหนึ่งที่ DNA ถูกให้ความร้อนที่อุณหภูมิสูงถึง 95 องศาเซลเซียสก็คือยิ่งสาย DNA สองสายยาวเท่าไรก็ยิ่งต้องการอยู่ด้วยกันมากขึ้นเท่านั้น ความยาวของ DNA เป็นปัจจัยหนึ่งที่ส่งผลต่อจุดหลอมเหลวที่เลือกสำหรับ PCR บน DNA ชิ้นนั้น เบส AT และ G-C จะจับคู่กันในพันธะ DNA แบบเกลียวคู่เพื่อยึดโครงสร้างแบบสองเกลียวไว้ด้วยกัน ยิ่งคู่เบสที่ต่อเนื่องกันระหว่างเกลียวเดี่ยวสองเกลียวผูกมัดมากเท่าใด เพื่อนบ้านของพวกมันก็ต้องการผูกมัดมากขึ้นเท่านั้น และแรงดึงดูดระหว่างเกลียวทั้งสองก็จะยิ่งแรงขึ้น เป็นเหมือนซิปที่ทำจากแม่เหล็กขนาดเล็ก ในขณะที่คุณปิดซิป แม่เหล็กจะต้องการรูดซิปและรูดซิปโดยธรรมชาติ

ปัจจัยอีกประการหนึ่งที่ส่งผลต่ออุณหภูมิหลอมเหลวที่จะเลือกสำหรับชิ้นส่วน DNA ของคุณที่น่าสนใจคือจำนวนคู่เบส G-C ที่มีอยู่ในชิ้นส่วนนั้น คู่เบสแต่ละคู่เปรียบเสมือนแม่เหล็กขนาดเล็กสองตัวที่ดึงดูด คู่ที่สร้างจาก G และ C จะดึงดูดมากกว่าคู่ A และ T อย่างมาก ดังนั้นชิ้นส่วนของ DNA ที่มีคู่ G-C มากกว่าชิ้นส่วนอื่นจะต้องใช้อุณหภูมิที่สูงกว่าก่อนที่จะหลอมรวมเป็นเส้นเดียว DNA ดูดซับแสงอัลตราไวโอเลตตามธรรมชาติ - ที่ความยาวคลื่น 260 นาโนเมตรเป็นที่แน่นอน - และ DNA สายเดี่ยวดูดซับแสงมากกว่า DNA ที่มีเกลียวคู่ ดังนั้นการวัดปริมาณแสงที่ดูดกลืนจึงเป็นวิธีการวัดว่า DNA ที่มีสายสองเส้นของคุณละลายไปเป็นสายเดี่ยวมากน้อยเพียงใด เอฟเฟกต์ "ซิปแม่เหล็ก" ของคู่ฐาน G-C และ AT เป็นสาเหตุของกราฟการดูดกลืนแสงของ ดีเอ็นเอสายคู่ถูกวางแผนต่อต้านการเพิ่มขึ้นของอุณหภูมิให้เป็นซิกมอยด์ มีรูปร่างคล้าย S และไม่ใช่ เส้นตรง. เส้นโค้งของ S แสดงถึงการต่อต้านการทำงานเป็นทีมที่คู่เบสทำกับความร้อนเพราะพวกเขาไม่ต้องการแยกจากกัน

อุณหภูมิที่ความยาวของ DNA ละลายเป็นเส้นเดียวเรียกว่าอุณหภูมิหลอมเหลวซึ่งแสดงโดยตัวย่อ "Tm" แสดงถึงอุณหภูมิที่ DNA ครึ่งหนึ่งในสารละลายหลอมละลายเป็นสายเดี่ยว และอีกครึ่งหนึ่งยังคงอยู่ในสายคู่ แบบฟอร์ม. อุณหภูมิหลอมเหลวจะแตกต่างกันไปในแต่ละส่วนของ DNA DNA ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมมีเนื้อหา G-C 40% ซึ่งหมายความว่า 60% ที่เหลือของคู่เบสคือ As และ Ts ปริมาณ G-C 40% ทำให้ DNA ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมละลายที่ 87 องศาเซลเซียส (ประมาณ 189 องศาฟาเรนไฮต์) นี่คือเหตุผลที่ขั้นตอนแรกของ PCR ใน DNA ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมคือการให้ความร้อนถึง 94 องศาเซลเซียส (201 องศาฟาเรนไฮต์) อุณหภูมิสูงกว่าอุณหภูมิหลอมเหลวเพียงเจ็ดองศา และเกลียวคู่ทั้งหมดจะละลายเป็นเกลียวเดียว