วิธีรวบรวมและเตรียมตัวอย่าง DNA เพื่อการศึกษา

ก่อนที่พวกเขาจะสามารถจัดลำดับ DNA หรือเปลี่ยนแปลงมันผ่านพันธุวิศวกรรม นักวิทยาศาสตร์ต้องแยกมันออกก่อน นี้อาจดูเหมือนเป็นงานที่ยาก เนื่องจากเซลล์ประกอบด้วยสารประกอบอื่นๆ มากมาย เช่น โปรตีน ไขมัน น้ำตาล และโมเลกุลขนาดเล็ก โชคดีที่นักชีววิทยาสามารถใช้คุณสมบัติทางเคมีของ DNA เพื่อแยก DNA ออกจากสารปนเปื้อนเหล่านี้และเตรียมสำหรับการศึกษาต่อไป กระบวนการนี้เรียกว่าการสกัดดีเอ็นเอ

มีเทคนิคต่างๆ มากมายที่ใช้สำหรับการสกัดดีเอ็นเอ ห้องปฏิบัติการที่ใช้โดยแต่ละห้องแล็บขึ้นอยู่กับประเภทของการทดลองที่จะดำเนินการและ DNA จะต้องบริสุทธิ์เพียงใด นักวิทยาศาสตร์มักเริ่มต้นด้วยตัวอย่างที่มีเซลล์ เช่น เนื้อเยื่อหรือตัวอย่างเลือด และทำลายเซลล์ที่เปิดออกหรือสลายเซลล์เหล่านั้น มีหลายวิธีที่คุณสามารถสลายเซลล์ได้ การเติมน้ำยาซักฟอกจะทำให้ผงซักฟอกหลุดออกจากกัน เช่นเดียวกับคลื่นเสียงความถี่สูง อีกทางหนึ่ง การผสมตัวอย่างกับลูกปัดแก้วและเขย่าอย่างรวดเร็วจะทำให้เซลล์แตกออกจากกันและปล่อยเนื้อหาออกมา

หากไม่ต้องการความบริสุทธิ์สูง นักวิทยาศาสตร์อาจเพิ่มเอนไซม์ที่เรียกว่าโปรตีเอสเคเพื่อสลายโปรตีนส่วนใหญ่ในตัวอย่างแล้วนำไปใช้ตามที่เป็นอยู่ เทคนิคนี้สกปรกมาก อย่างไรก็ตาม เนื่องจากสารปนเปื้อนส่วนใหญ่ยังคงมีอยู่ ดังนั้นจึงเหมาะก็ต่อเมื่อความเร็วเป็นสิ่งสำคัญอันดับแรกและไม่มีปัญหาเรื่องความบริสุทธิ์ อีกวิธีหนึ่งที่รวดเร็วและสกปรกคือการกำจัดโปรตีนโดยการเพิ่มความเข้มข้นของเกลือโดยการเพิ่มเกลือเช่นแอมโมเนียมหรือโพแทสเซียมอะซิเตทเพื่อบังคับให้โปรตีนตกตะกอน เทคนิคนี้ค่อนข้างสกปรกเนื่องจากมีสารปนเปื้อนอื่นๆ อยู่มากมาย

อีกวิธีหนึ่งคือการสลายเซลล์ด้วยผงซักฟอก จากนั้นผสมสารละลายกับไอโซเอมิลแอลกอฮอล์ คลอโรฟอร์ม และฟีนอล สารละลายจะแยกออกเป็นสองชั้น โปรตีนจะจบลงที่ชั้นอินทรีย์ด้านบน ในขณะที่ DNA ยังคงอยู่ในชั้นน้ำที่ต่ำกว่า เทคนิคนี้ต้องควบคุมความเข้มข้นของเกลือและ pH อย่างระมัดระวังเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ดี ใช้เวลานาน และทั้งฟีนอลและคลอโรฟอร์มเป็นสารเคมีที่เป็นพิษสูง ดังนั้น แม้ว่าการสกัดฟีนอล-คลอโรฟอร์มครั้งหนึ่งเคยเป็นกิจวัตร แต่เทคนิคอื่นๆ ก็ได้รับความนิยมมากขึ้นในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา

Anion-exchange chromatography ให้ความบริสุทธิ์และผลลัพธ์ที่สม่ำเสมอมากกว่าการสกัดด้วยฟีนอล-คลอโรฟอร์ม หลอดหรือคอลัมน์บรรจุด้วยอนุภาคขนาดเล็กที่มีไซต์ที่มีประจุบวกอยู่บนนั้น ซึ่งโมเลกุลหรือประจุลบที่มีประจุลบสามารถจับได้ ดีเอ็นเอจับกับจุดแลกเปลี่ยนประจุลบ ขณะที่สารปนเปื้อนอื่นๆ เช่น โปรตีนและอาร์เอ็นเอจะถูกชะล้างออกจากคอลัมน์ ต่อมา ใช้สารละลายที่มีเกลือสูงเพื่อดึง DNA ออกจากคอลัมน์

เทคนิคที่รวดเร็วและน่าเชื่อถือที่สุดในการทำให้ DNA บริสุทธิ์คือการใช้ชุดอุปกรณ์ที่ผลิตขึ้นเป็นพิเศษ ชุดอุปกรณ์เหล่านี้ประกอบด้วยเยื่อซิลิกาเจลในหลอด ดีเอ็นเอเกาะติดกับเมมเบรนในขณะที่สารปนเปื้อนอื่นๆ ถูกชะล้างออกไปโดยใช้สารละลายเกลือที่เตรียมมาเป็นพิเศษซึ่งมาพร้อมกับชุดอุปกรณ์ ในที่สุด DNA จะถูกชะล้างออกจากคอลัมน์ด้วยสารละลายเกลือต่ำ ชุดเครื่องมือเหล่านี้รวดเร็ว ใช้งานง่าย และให้ผลลัพธ์ที่ทำซ้ำได้

เมื่อแยก DNA และแขวนลอยใหม่ในสารละลายบัฟเฟอร์ที่ควบคุมด้วย pH แล้ว ขั้นตอนสุดท้ายคือการทดสอบความบริสุทธิ์ วิธีที่ง่ายและสะดวกคือการตรวจสอบว่าแสงอัลตราไวโอเลตดูดซับแสงที่ความยาวคลื่น 260 และ 280 นาโนเมตรได้มากน้อยเพียงใด การดูดซึมที่ 260 นาโนเมตรหารด้วยการดูดซึมที่ 280 นาโนเมตรควรเท่ากับ 1.8 ถ้า DNA บริสุทธิ์ การวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 260 นาโนเมตรยังช่วยให้คุณกำหนดความเข้มข้นของ DNA ได้อีกด้วย