ข้อเสียของการซับแบบตะวันตก

Western blotting เป็นหนึ่งในขั้นตอนที่พบบ่อยที่สุดในห้องปฏิบัติการทางชีวเคมี โดยพื้นฐานแล้ว มันจะแยกโปรตีนออกจากตัวอย่างตามขนาด จากนั้นทำการทดสอบโดยใช้แอนติบอดีเพื่อตรวจสอบว่ามีโปรตีนที่กำหนดหรือไม่ มีประโยชน์ไม่เพียงแต่ในการวิจัยเท่านั้น แต่ยังมีประโยชน์ในห้องปฏิบัติการทางการแพทย์หรือห้องปฏิบัติการวินิจฉัยอีกด้วย การทดสอบทั้งโรค HIV และ Lyme เช่น เกี่ยวข้องกับการทดสอบ immunosorbent assay (ELISA) ที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ ตามด้วย Western blot หาก ELISA มีผลตรวจเป็นบวก แม้จะได้รับความนิยม แต่ Western blotting มีข้อเสียหลายประการ

blots แบบตะวันตกคลาสสิกนั้นไม่ใช่เชิงปริมาณ กล่าวอีกนัยหนึ่งในขณะที่พวกเขาสามารถบอกนักวิจัยว่ามีโปรตีนชนิดใดอยู่หรือไม่ แต่ก็ไม่สามารถหาปริมาณโปรตีนที่มีอยู่ได้ ปัจจุบันบริษัทเทคโนโลยีชีวภาพบางแห่งขายชุดอุปกรณ์ที่ช่วยให้นักวิจัยหรือช่างเทคนิคในห้องปฏิบัติการสามารถหาปริมาณได้ โปรตีนที่มีอยู่โดยใช้เส้นโค้งมาตรฐาน -- แต่จะใช้ได้ก็ต่อเมื่อตัวอย่างบริสุทธิ์ของโปรตีนเดียวกันคือ ใช้ได้ ยิ่งไปกว่านั้น น้ำหนักโมเลกุลของโปรตีนสามารถประมาณได้โดยใช้ Western blotting เท่านั้น มากกว่าที่จะกำหนดได้อย่างแม่นยำเช่นเดียวกับแมสสเปกโตรเมตรี

Western blot สามารถทำได้ก็ต่อเมื่อมีแอนติบอดีหลักที่ต่อต้านโปรตีนที่สนใจ แม้ว่าแอนติบอดีสำหรับโปรตีนหลายชนิดจะหาซื้อได้จากบริษัทเทคโนโลยีชีวภาพ แต่ก็ไม่ได้ราคาถูก หากไม่มีแอนติบอดีปฐมภูมิสำหรับโปรตีนที่กำหนด จะไม่สามารถทำ Western blot เพื่อค้นหาโปรตีนชนิดนั้นได้ นอกจากนี้ นักวิจัยอาจต้องการตรวจสอบว่ามีการดัดแปลงโปรตีนในทางใดทางหนึ่งหรือไม่ หากได้รับฟอสโฟรีเลต (มี กลุ่มฟอสเฟตที่ติดอยู่กับมัน) ตัวอย่างเช่น -- และด้วยเทคนิค Western blot พวกเขาต้องการแอนติบอดีจำเพาะต่อตัวดัดแปลง โปรตีน.

การแสดง Western blot อย่างถูกต้องและได้ผลลัพธ์ที่ดีอาจเป็นเรื่องยาก ดังนั้นพนักงานจึงต้องได้รับการฝึกอบรมมาเป็นอย่างดี ประสบการณ์อาจเป็นติวเตอร์ที่ดีที่สุด แม้แต่สำหรับช่างเทคนิคที่มีประสบการณ์ แต่ Western blot ก็ใช้เวลานาน ตัวอย่างเช่น ส่วนเจลอิเล็กโตรโฟรีซิสของการทดลอง โดยทั่วไปจะใช้เวลาหนึ่งถึงสองชั่วโมงในการทำงาน งานอื่นๆ สามารถทำได้ในขณะที่เจลกำลังทำงาน แต่การทดลองยังต้องใช้เวลาพอสมควรกว่าจะได้ผลลัพธ์

บางครั้งแอนติบอดีอาจแสดงการจับนอกเป้าหมาย ซึ่งอาจทำให้ผลลัพธ์แย่ลง ยิ่งไปกว่านั้น เมื่อใช้ Western blotting คุณใช้แอนติบอดีต่อโปรตีนจำเพาะ ดังนั้นผลลัพธ์ของคุณจะบอกคุณได้ก็ต่อเมื่อมีโปรตีนนั้นอยู่ ในทางตรงกันข้าม แมสสเปกโตรเมตรีความละเอียดสูงเผยให้เห็นโปรตีนทั้งหมดที่มีอยู่ในตัวอย่าง และไม่เหมือนกับการซับแบบตะวันตกแบบคลาสสิก มันเป็นเชิงปริมาณ สิ่งสำคัญที่ต้องจำไว้คือ แน่นอนว่าแมสสเปกโตรเมตรีมีราคาแพงกว่ามาก และยังมีความท้าทายทางเทคนิคในการใช้งานเมื่อเทียบกับ Western blotting