การมองเห็น DNA โดยใช้เจลอิเล็กโทรโฟเรซิสเป็นอย่างไร?

เจลอิเล็กโตรโฟรีซิสเป็นเทคนิคที่ช่วยให้วิเคราะห์ดีเอ็นเอในระดับโมเลกุลที่เป็นส่วนประกอบ ในวิธีการสร้างภาพดีเอ็นเอนี้ ตัวอย่างจะถูกวางบนสื่อเจลอากาโรสและใช้สนามไฟฟ้ากับเจล ทำให้ชิ้นส่วนของ DNA เคลื่อนตัวผ่านเจลในอัตราที่แตกต่างกันตามคุณสมบัติทางเคมีไฟฟ้าของพวกมัน

เอทิเดียมโบรไมด์

สำหรับเทคนิคการสร้างภาพข้อมูลนี้ เอทิเดียมโบรไมด์จะถูกผสมกับผงอากาโรส บัฟเฟอร์ EDTA และน้ำ เพื่อสร้างเมทริกซ์เจลก่อนอิเล็กโตรโฟรีซิส เป็นผลให้โมเลกุลของเอธิเดียมโบรไมด์กระจายตัวอย่างสม่ำเสมอทั่วทั้งเมทริกซ์ เมื่อบ่อน้ำของเจลเต็มไปด้วยตัวอย่างดีเอ็นเอและสีย้อมติดตามลำดับแล้ว แรงดันไฟฟ้าจะถูกนำไปใช้เพื่อค่อยๆ ดึงสารประกอบที่มีขั้วขนาดใหญ่ไปทั่วเมทริกซ์

ในระหว่างการเคลื่อนที่นี้ ฐานของโมเลกุลดีเอ็นเอจับกับอนุภาคชั่วคราวด้วยประจุเอทิเดียมโบรไมด์และลากไปตาม เมื่อถึงเวลาเจลอิเล็กโตรโฟรีซิสจะเสร็จสมบูรณ์ โมเลกุลดีเอ็นเอแต่ละโมเลกุลจะจับที่เอทิเดียมโบรไมด์ในปริมาณที่มีนัยสำคัญ

ในที่ที่มีแสงอัลตราไวโอเลต เอทิเดียมโบรไมด์จะแสดงการเรืองแสง ช่างเทคนิคจะฉายแสงยูวีที่ปรับเทียบพิเศษให้ทั่วเจล ในขณะที่เครื่องจับภาพชิ้นส่วนที่เรืองแสง

instagram story viewer

เมทิลีนบลู

หากไม่มีเครื่องทรานส์ลูมิเนเตอร์ UV หรือใช้งานได้จริง ช่างเทคนิคสามารถทำให้ DNA มองเห็นได้ภายใต้สภาวะปกติ โดยการแช่เจล agarose ที่เสร็จแล้ว ที่มี DNA อิเล็กโตรโฟรีซิสอยู่ภายใน ในสารละลายของเมทิลีนบลูในชั่วข้ามคืน

เกลือคลอไรด์ที่มีประจุลบที่ไม่ชอบน้ำอย่างมีนัยสำคัญ โมเลกุลของเมทิลีนบลูแทรกซึมเข้าไปในเมทริกซ์เจลทั้งหมด อย่างไรก็ตาม พันธะไฮโดรเจนทั่ว DNA ทำให้โมเลกุลของคราบสะสม ความหนาแน่นของคราบ DNA ที่เพิ่มขึ้นนี้ทำให้ได้เฉดสีน้ำเงินที่ลึกกว่า มองเห็นได้ด้วยตาเปล่า

ติดตามสีย้อม

นอกเหนือจากขนาดสัมพัทธ์ของแถบดีเอ็นเอแล้ว ช่างเทคนิคสามารถวัดขนาดสัมบูรณ์ (ในคู่เบส) ของแต่ละชิ้นส่วนโดยใช้สารเคมีที่เรียกว่าสีย้อมติด มองเห็นได้โดยไม่ต้องเติมเมทิลีนบลูหรือเอธิเดียมโบรไมด์ สีย้อมติด เช่น โบรโมฟีนอลบลูและไซยานอลจะเคลื่อนผ่าน เมทริกซ์เจลอาราโกสระหว่างอิเล็กโตรโฟรีซิสด้วยความเร็วเดียวกับชิ้นส่วนดีเอ็นเอซึ่งประกอบด้วยนิวคลีโอไทด์ 300 ตัวและนิวคลีโอไทด์ 4,000 ตัว ตามลำดับ ในอิเล็กโตรโฟรีซิส ชิ้นส่วน DNA ที่มีมวลมากกว่าเดินทางผ่านเมทริกซ์เจลด้วยความเร็วที่ช้ากว่าชิ้นส่วนที่เล็กกว่า ดังนั้น ในขณะที่การย้อมติดติดตามไม่ส่งผลโดยตรงต่อการมองเห็นชิ้นส่วนดีเอ็นเอ การเปรียบเทียบตำแหน่งของชิ้นส่วนดีเอ็นเอ ในเจลไปยังตำแหน่งของสีย้อมเหล่านี้ช่วยให้ช่าง "เห็น" จำนวนนิวคลีโอไทด์โดยประมาณของชิ้นส่วนดีเอ็นเอ ประกอบด้วย

Teachs.ru
  • แบ่งปัน
instagram viewer