Recombinant DNA ถูกสร้างขึ้นมาได้อย่างไร?

Recombinant DNA (กรดดีออกซีไรโบนิวคลีอิก) เป็นกรดนิวคลีอิกสังเคราะห์ที่สร้างขึ้นโดยการเชื่อมโยงดีเอ็นเอ ร่วมกันซึ่งจะไม่มีอยู่ตามธรรมชาติภายใต้สภาวะปกติและสิ่งแวดล้อม เงื่อนไข

กระบวนการสร้าง recombinant DNA มักทำด้วย recombinant plasmid โดยเฉพาะอย่างยิ่ง มันถูกสร้างขึ้นโดยขั้นตอนทางเทคโนโลยีดีเอ็นเอขั้นสูงในด้านชีววิทยาและพันธุศาสตร์ที่เรียกว่าการโคลนยีน ดีเอ็นเอลูกผสมถูกใส่เข้าไปในเซลล์ ซึ่งจะผลิตโปรตีนใหม่ทั้งหมด และใช้เพื่อสังเคราะห์ยา แอนติบอดี หรือโปรตีนเฉพาะสำหรับการวิจัยเท่านั้น

ดีเอ็นเอจากสิ่งมีชีวิตผู้บริจาคหรือแหล่งทางชีวภาพจะถูกสกัดจากเซลล์ก่อน จากนั้นจึงนำไปผ่านกระบวนการตัดที่เรียกว่าการจำกัดของเอนไซม์ สิ่งนี้สร้างชิ้นส่วนของ DNA ที่มียีนหรือยีนที่น่าสนใจ ชิ้นส่วนเหล่านี้สามารถ "ลอกแบบ" (เช่น ใส่เข้าไป) หรือติดบนชิ้นส่วนจากสิ่งมีชีวิตของผู้รับ

ต่อไปจะถูกแทรกเข้าไปในโมเลกุล DNA ที่มีขนาดใหญ่กว่า ("recombinant plasmid") ซึ่งถูกใส่เข้าไปในแบคทีเรียและปล่อยให้ทวีคูณ จากนั้น DNA รีคอมบิแนนท์จะถูกกู้คืนและตรวจสอบ

อ่านเพิ่มเติมเกี่ยวกับข้อดีและข้อเสียของเทคโนโลยี recombinant DNA

ขั้นแรกต้องสกัดดีเอ็นเอและทำให้บริสุทธิ์จากโมเลกุลของเซลล์อื่นๆ เช่น กรดไรโบนิวคลีอิก (RNA) โปรตีน และโครงสร้าง เช่น เยื่อหุ้มเซลล์ เพื่อวัตถุประสงค์ในการโคลนนิ่ง ดีเอ็นเอได้มาจากนิวเคลียสและเรียกว่า "จีโนมดีเอ็นเอ" วิธีหนึ่งทั่วไปสำหรับ DNA การสกัดทำได้โดยการหมุนเหวี่ยงด้วยอัลตร้าโซนิคของส่วนประกอบเซลล์ในการไล่ระดับความหนาแน่นที่ประกอบด้วยเอธิเดียมโบรไมด์ในซีเซียม คลอไรด์

อีกทางหนึ่ง สามารถใช้ชุดล้างอัลคาไลน์และบัฟเฟอร์เกลือเพื่อกู้คืน DNA ได้เช่นกัน เมื่อสิ่งนี้ถูกตกตะกอนและทำความสะอาดสิ่งปนเปื้อนที่ไม่ต้องการอื่น ๆ ทั้งหมด DNA จะถูกตัดเป็นชิ้นเล็กชิ้นน้อย

เอ็นไซม์จำกัดคือเอ็นไซม์ที่ตัดลำดับดีเอ็นเอที่เฉพาะเจาะจงมาก พวกมันถูกใช้เพื่อสร้างชิ้นส่วน DNA ที่ไม่เหมือนใคร กระบวนการนี้ทำให้มั่นใจได้ว่าจะไม่มีการสร้างลำดับที่ไม่ถูกต้อง ไม่ถูกต้อง หรือไม่ต้องการขึ้นและกลายเป็น รวมเข้ากับดีเอ็นเอลูกผสมสุดท้ายโดยไม่ได้ตั้งใจ ซึ่งอาจส่งผลให้ทั้งการทดลองล้มเหลวและ การตายของเซลล์

ในการสร้างชิ้นส่วน DNA ที่ต้องการ จะใช้เอ็นไซม์เดี่ยว (หรือรวมกัน) เพื่อตัดหรือย่อย DNA ชิ้นส่วนจะถูกทำให้บริสุทธิ์ด้วยเจลอิเล็กโตรโฟรีซิส ซึ่งแยกพวกมันออกจาก DNA ที่ไม่ต้องการ วิธีการทางเทคโนโลยี DNA แบบหยาบนั้นเกี่ยวข้องกับการตัดเฉือนทางกล ซึ่งฉีกส่วน DNA ที่ยาวกว่าออกเป็นส่วนเล็ก ๆ ที่สามารถใช้ในการโคลนได้

Ligation เป็นกระบวนการของการเกาะติดหรือเชื่อมชิ้นส่วนดีเอ็นเอของผู้บริจาคและผู้รับ (หรือเวกเตอร์) เข้าด้วยกันเพื่อสร้างโมเลกุลดีเอ็นเอพลาสมิดลูกผสม ตามหลักการแล้ว เอ็นไซม์ควบคุมที่ถูกเลือกเพื่อสร้างชิ้นส่วนนั้นจะต้องได้รับการคิดและออกแบบอย่างระมัดระวังเพื่อให้ชิ้นส่วนเหล่านี้สามารถประกอบเข้าด้วยกันได้ราวกับจิ๊กซอว์

ในการทำเช่นนี้ แนะนำให้ใช้เอ็นไซม์จำกัดที่ผลิต "ปลายเหนียว" ที่เข้ากันได้ เพื่อให้ชิ้นส่วนที่เข้ากันได้ทั้งหมดจะรวมเข้าด้วยกันอย่างเป็นธรรมชาติ มิฉะนั้น เอ็นไซม์ DNA ligase สามารถใช้เชื่อมส่วน DNA ด้วยการเชื่อมโยงฟอสโฟไดสเตอร์

กระบวนการเปลี่ยนรูปหรือความร้อนช็อกถูกใช้เพื่อใส่โมเลกุลดีเอ็นเอลูกผสมเข้าไปในเซลล์แบคทีเรียเจ้าบ้าน ซึ่งจะสร้างสำเนาดีเอ็นเอสังเคราะห์ได้หลายชุด แบคทีเรียเหล่านี้เติบโตบนจานวุ้น เพาะเลี้ยงในน้ำซุปแบคทีเรียชนิดพิเศษ จากนั้นแยกสลายเพื่อปลดปล่อย DNA รีคอมบิแนนท์ ในที่สุด ดีเอ็นเอสามารถตรวจสอบได้โดยการจัดลำดับดีเอ็นเอ การทดลองเชิงฟังก์ชัน และการย่อยของเอนไซม์จำกัด

เทคโนโลยี Recombinant DNA ใช้สำหรับทุกอย่างตั้งแต่การทดลองในห้องปฏิบัติการทางวิชาการไปจนถึงการสร้างยารักษาโรค นอกจากนี้ยังเป็นส่วนสำคัญของการจัดลำดับดีเอ็นเอและการระบุยีน

คุณสามารถอ่านเพิ่มเติมเกี่ยวกับการใช้สิ่งนี้ เทคโนโลยีดีเอ็นเอที่นี่.

อ่านเพิ่มเติมเกี่ยวกับความแตกต่างระหว่างดีเอ็นเอลูกผสมและพันธุวิศวกรรม