Vad är frysfrakturering och varför är det användbart i cellbiologi?

Cellmembran består av fosfolipider och fästa eller inbäddade proteiner. Membranproteiner spelar viktiga roller i cellens ämnesomsättning och liv. Du kan inte använda vanlig mikroskopi för att visualisera eller karakterisera vidhäftningsproteiner, transportera proteiner och proteinkanaler i cellmembranet. Med elektronmikroskopi och en teknik som kallas "frysfraktur", som delar upp frusna cellmembran, möjliggör visualisering av membranstrukturen och organisering av proteiner i havet av fosfolipider. Att kombinera andra metoder med frysfrakturering hjälper oss inte bara att förstå strukturen hos olika cellmembran och membranproteiner, men möjliggör visualisering och detaljerad analys av funktionen hos specifika proteiner, bakterier och virus.

Med flytande kväve fryses biologiska vävnadsprover eller celler snabbt för att immobilisera cellbeståndsdelar. Cellmembran består av två lager fosfolipider, kallade dubbelskikt, där de hydrofoba, eller vattenhatande, lipidsvansarna pekar mot insidan av membranet och de hydrofila eller vattenälskande ändarna av lipidmolekylen pekar utåt och mot insidan av cell. Det frysta provet är knäckt eller sprickat med en mikrotom, som är ett knivliknande instrument för att skära tunna vävnadsskivor. Detta får cellmembranet att splittras exakt mellan de två skikten eftersom attraktionen mellan de hydrofoba lipidsvansarna representerar den svagaste punkten. Efter sprickbildning genomgår provet ett vakuumförfarande, kallat "frysetsning". Sprickans yta provet skuggas med kol och platinaånga för att göra en stabil replika, som följer frakturens konturer plan. Syra används för att smälta organiskt material som fäster vid repliken, vilket lämnar ett tunt platinaskal av den brutna membranytan. Detta skal analyseras sedan med elektronmikroskopi.

Frysetsning är vakuumtorkning av ett ofixerat, fryst och frysfrakturerat biologiskt prov. Vakuumtorkningsproceduren liknar frystorkande frukter och grönsaker som förpackas och säljs i livsmedelsbutiker. Utan frysning etsas många detaljer i cellstrukturen av iskristaller. Steget för djup- eller frysetsning förbättrar och utvidgar den ursprungliga frysfrakturmetoden, vilket möjliggör observation av cellmembran under olika aktiviteter. Det möjliggör analys av inte bara membranstrukturen utan också av intracellulära komponenter och ger detaljerad strukturell information om bakterier, virus och stort cellulärt protein komplex.

Elektronmikroskopi kan avslöja och förstora mer än en miljon gånger de minsta organismerna eller strukturerna, såsom bakterier, virus, intracellulära komponenter och till och med proteiner. Visualisering skapas genom att bombardera ett ultratunt prov med en elektronstråle. De två elektronmikroskopimetoderna är skanningelektronmikroskopi, eller SEM, och transmissionselektronmikroskopi, eller TEM. Frysfrakturprover analyseras rutinmässigt med TEM. TEM har bättre upplösning än SEM och erbjuder strukturell information ner till 3 nanometer repliker.

Utvecklingen och användningen av frysfrakturelektronmikroskopi visade att cellplasmamembran består av lipid dubbelskikt och klargjorde hur proteiner organiseras i cellmembran. Frysfraktur ger en unik inblick i cellmembranets inre, eftersom den delar upp och separerar membranfosfolipider i två motsatta och kompletterande ark eller ansikten. På mer än 50 år sedan introduktionen av den första frysfrakturmaskinen är det fortfarande det enda sättet att få strukturell information om cellmembranet att göra en platina-replika. Tekniken visar om specifika proteiner flyter eller är förankrade i cellmembranet, och huruvida och hur vissa proteiner aggregerar. En nyare metod - med antikroppar som riktar sig mot specifika proteiner - kombineras med frysfraktur för att identifiera proteiner och deras funktion i cellmembranet.